人参皂苷类化合物HPLC分析方法的建立

　　很多人在液相实验中经常会遇到“分不开”的问题，下面就以人参皂苷类化合物分析为例，一起来看看该问题如何解决？

　　同学目前所做的尝试
　　1. 使用T家C18柱，Rg1和Re未实现基线分离（分离度R<1.5）；
　　2. 更换色谱柱为A家C18，在相同条件下，同样未实现Rg1和Re的基线分离；
　　3. 在A家C18色谱柱的基础上，调整流动相梯度，Rg1和Re可以满足基线分离，但是其他人参皂苷（Rb1、Rb2、Rc和Rd）分离不理想。
　　同学的诉求是寻找一个合适的HPLC分析方法（包括色谱柱和流动相），能够实现样品中所有人参皂苷的良好分离（ Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1）。 

　　通常来说，建立合适的HPLC分析方法，你需要：
　　01确定分离目标，明确方法要求；
　　02解析目标分析物，包括化合物结构、分子量、吸收光谱、pKa和化学稳定性等方面信息；
　　03对收集到的信息进行综合分析和考虑，选择合适的色谱柱（固定相），设计合适的实验条件；
　　04使用挑选的色谱柱和实验条件进行分析，根据结果调整色谱柱和实验条件；
　　05在合适的色谱柱和实验条件下，进行相关验证，最终得到稳定靠谱的实验方法。

　　针对今天的案例，我们一条条看：
　　分离目标和方法要求
　　首先，我们明确这个实验的目的是通过合适的HPLC方法实现人参皂苷化合物 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1的分离。

　　解析目标分析物
　　建立合适的人参皂苷HPLC分析方法，需要进行全方位的考虑，其中化合物结构是至关重要的点。
　　人参皂苷（ Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1等 ）是人参的主要成分，都具有相似的基本结构：含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。
　　
　　它们都具备以下特点：
　　1. 化合物偏中性，具备一定的疏水性；
　　2. 不同化合物之间的差异在于糖分子的种类和数量，结构比较接近，甚至属于同分异构体；
　　3. 分子量在800-1200，分子结构偏大（小分子领域）。

　　选择色谱柱和实验条件
　　根据人参皂苷化合物的这些特点，我们确定了建立HPLC方法的要点：
　　1. 偏中性化合物，流动相可以采用非缓冲的水溶液，甚至纯水相；
　　2. 具备一定疏水性的结构相近化合物，色谱柱考虑采用C18固定相，使用等度或缓梯度；
　　3. 分子物理尺寸偏大，孔径在分离中有可能发挥重要作用，需要仔细考察此点。
 
　　调整色谱柱和实验条件
　　2020版中国药典人参的含量测定项规定的色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
　　但是中国药典方法中并没有明确色谱柱的细节，包括色谱柱规格、固定相粒径和孔径，而这些往往会影响分离效果。
　　我们先按照该方法，使用相同规格的不同孔径ChromCore 120 C18（120 ?）和ChromCore C18 （180 ?）对人参皂苷Rg1和Re进行分析，得到如下结果：
　　
　　在药典人参方法下，人参皂苷Rg1和Re在ChromCore 120 C18（120 ?）和ChromCore C18 （180 ?）上都能获得良好的峰型，在ChromCore C18 （180 ?）获得更好的分离度（R>2.0），满足药典要求。
　　ChromCore 120 C18（120 ?）和ChromCore C18 （180 ?）两款色谱柱采用相同的硅胶基质和键合工艺，主要差别在于孔径。
　　另外，2020版中国药典西洋参的含量测定项规定的色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
　　我们再按照该方法，使用相同规格的不同孔径ChromCore C18（180 ?）和ChromCore 300 C18 （300 ?）对人参皂苷Rg1和Re进行分析（两种人参皂苷在ChromCore 120 C18上共流出，谱图未放）：
　　
　　在药典西洋参方法下，人参皂苷Rg1和Re在ChromCore C18（180 ?）未获得基线分离，而在ChromCore 300 C18 （300 ?）获得更好的分离度，完全满足药典要求。
　　西洋参方法中梯度斜率高于人参方法（梯度更陡），因此人参方法适用的ChromCore C18（180 ?）在西洋参方法下，无法实现Rg1和Re的基线分离。
　　由此可见，在分离分子尺寸较大且结构相似的化合物时，不仅要选用合适的固定相官能团，更要注意固定相基质孔径的选择，以达到最佳的分离效果。
　
　　得到稳定靠谱实验方法
　　经过上面实验的对比，最后我们选用ChromCore 300 C18 （300 ?），在中国药典人参方法下，对7种人参皂苷进行分析：
　　
　　由以上谱图可知，7种人参皂苷在ChromCore 300 C18 （300 ?）上都能获得良好的峰型和分离，完全满足HPLC定性和定量要求。
　　也就是说，在人参皂苷等物理尺寸较大的化合物HPLC分析中，大孔径固定相色谱柱有利于结构相近组分的分离。
　
　　希望今天这个案例的梳理，能够对你的HPLC分析方法开发工作有所启发和帮助。