研新秀技术：空间代谢组学研究揭示肺纤维化中糖代谢的变化

　　肺纤维化是一种常见的肺部疾病，指肺部组织过度纤维化，最终导致肺部功能受损。近年来，研究表明糖代谢异常与肺纤维化的发生密切相关。糖代谢过程中产生的中间产物可以刺激肺部组织，糖代谢异常影响免疫系统功能，加剧炎症反应，从而导致肺纤维化的发生。

　　近年，随着空间代谢组学技术的发展，为研究肺纤维化的机制提供了新的手段，通过分析糖代谢特征，可以更好地了解肺纤维化的发病机制，为治疗提供新的思路。

  

 

　　01研究简介

　　临床上福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本极具研究开发潜力，利用最新质谱成像技术，可以利用肺纤维化的FFPE样本获取病理和代谢数据，挖掘更贴近临床实际的信息。

 

　　02研究目的

　　利用空间代谢组学研究肺纤维化疾病，探讨以质谱成像技术来分析糖代谢异常、挖掘标志物，讨论糖原代谢在肺纤维化中的作用，并探索其作为该疾病治疗靶点的潜力。

 

　　03研究方法

　　采用质谱成像（MALDI-MSI）技术，依次检测人肺纤维化FFPE样本、基因缺陷小鼠诱导肺纤维化模型样本，考察分析糖原及N-聚糖的表达异同；结合H&E染色、免疫荧光染色技术，进行空间定位比较分析；利用靶向蛋白质组学技术，验证胶原蛋白变化；利用同位素示踪方法，结合液相色谱与气相色谱鉴定，验证糖原代谢通路变化。

 

　　04研究结果

　　1.研究团队基于空间代谢组学，建立了糖原代谢检测与整合分析方法，经肝组织切片验证，表明了HDR-SC方法在整合病理切片和代谢特征方面的准确性。

　　2.继而应用质谱成像技术对肺纤维化临床样本检测，发现纤维化核心区域糖原及N-聚糖上调，获得了空间分布信息。

　　3.利用Epm2a基因缺陷小鼠，获得博莱霉素诱导型肺纤维化模型，已知该基因缺失导致糖原代谢障碍，经空间多组学检测后，发现该基因缺失可减弱肺纤维化程度。

　　4.机制研究发现，病变成纤维细胞中，存在糖原代谢异常途径，酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）基因缺陷小鼠实验证明，溶酶体挽救途径利用糖原，对肺纤维化的发展至关重要。

 

　　05研究结论

　　空间代谢组学发现，糖原及N-聚糖在肺纤维化患者样本中富集，差异分析确定了该簇物质作为生物标记物的可能性。机制研究表明，肺纤维化对糖原代谢需求增加，因此靶向糖原代谢的治疗药物，可以为肺纤维化患者提供潜在的治疗途径。

　　研究结果展开：

　　图1.展示本文中质谱成像检测糖代谢与多维数据处理方法

　　图1a显示细胞内糖代谢示意图，糖原及N-聚糖经内质网（ER）和高尔基体合成，对细胞功能至关重要。

　　图b显示FFPE样本开展质谱成像检测示意图，样本切片后摊到载玻片上，孵育以N-糖苷酶F（PNGase F）和异淀粉酶，以释放出N-聚糖和线性寡糖链，继而覆盖α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）电离基质，之后以MALDI-TOF-MS进行检测分析。

　　图c左侧表示对于每个像素点，激光解吸附电离后，质谱所捕获的质谱图；右侧表示这些激发离子的空间热图，基于像素点的总离子流(TIC)强度而产生。

　　图d-f显示该技术在人肝脏样本上的验证，图d为肝切片上全部像素的TIC图；图e为糖原或N-聚糖所产生的3种离子的空间热图，对应切片的H&E染色图；图f在图e的基础上，选取一种离子的空间热图，展示了三个代表性像素点的TIC图。

　　图g为数据分析流程示意图，简称为HDR-SC，其核心为对于质谱成像的高纬数据集，进行降维，以及聚类分析，结合空间信息，能够准确对应到组织病理学分析。

　　图h以热图显示人肝脏样本糖代谢空间质谱数据，包含像素信息（列），荷质比数据（行），及信号强度。

　　图i-k显示经过HDR-SC流程，对图h显示的空间代谢数据进行二维呈现，统一流形逼近与投影(Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP)算法可以有效呈现高维数据；图i显示HDR-SC分析后，人体肝脏样本的UMAP图和空间图；图j仅显示基质CHCA的信号数据；图k展示去除基质CHCA信号后，肝脏切片糖代谢空间差异的UMAP和空间分布图。

　　图2.临床肺纤维化和COVID-19肺脏样本空间代谢组学检测

　　图2a展示特发性肺纤维化（IPF）病理切片代表性图像，经评估后适用于质谱成像实验。

　　图b和c展示一个完整IPF切片的空间代谢检测聚类分析与注释结果，图b显示UMAP图（左）和空间分布图（右）；图c为病理专家对分型的专家注释：平滑肌（簇0）、终末期纤维化（簇5）、弥漫性肺泡损伤（DAD）（簇6）、气道中的粘蛋白积聚和蜂窝状变化（簇10）、水肿疏松基质（簇11）。

　　图d和e具体展示了IPF切片中的三个具体区域，包含弥漫性肺泡损伤(DAD)、终末期纤维化和黏蛋白聚集区，图d显示它们的H&E染色图像，图e相应展示了这三个区的空间代谢分布。

　　图f-h展示了新冠患者肺部组织病理切片空间代谢实验结果，图f为切片代表性图像，图g显示UMAP图（左）和空间分布图（右）；图h为病理专家对分型的专家注释：早期纤维化（簇1）、中期纤维化（簇0）和终末期纤维化（簇3和4）、DAD（簇6和8）、气道中粘蛋白聚集（簇12）。

　　图i和j具体展示了新冠患者肺部病理切片中的三个具体区域，同样包含弥漫性肺泡损伤(DAD)、终末期纤维化和黏蛋白聚集区，图i显示它们的H&E染色图像，图j相应展示了这三个区的空间代谢分布。

　　图k展示切片中肺纤维化区和DAD区之间的糖代谢差异，横向为糖原或N-聚糖表达高低，纵向为该区内像素位点信息，可观察到肺纤维化区存在特征性表达，比如岩藻糖基化的N-聚糖高表达。

　　图l展示了基于新发现和已有研究而绘制的示意图，显示肺纤维化区域同时存在糖原累积（右），而正常肺组织则没有累积现象（左）。

　　图m展示实验中IPF实验组（n=3，左）和COVID-19实验组（n=2）的病理切片，图n展示荷质比为1175的糖原在切片中的空间分布和热图，显示纤维化区中该类型糖原富集。

　　图o则应用免疫荧光（IF）实验，进一步证明糖原在肺纤维化区域定位的观察结果，通过使用糖原抗体和抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体，进行IF共定位分析，证实了糖原福基于纤维化区的肌成纤维细胞群。糖原（红色）、α-SMA（绿色）、DAPI（蓝色）。

　　图3.肺纤维化患者临床样本
　　经空间代谢组学检测显示糖原代谢异常的特征

　　图3a显示正常（N）和纤维化（F）肺组织的比较，表明糖原代谢物（7碳，m/z=1175）在空间分布上的差异，检测对象为组织微阵列(tissue microarray,TMA)，包括26例患者肺部纤维化组织样本和7例正常肺组织样本，证实了两个群体之间，在肺部存在糖原代谢差异。
　　图b清晰表明两组样本之间总糖原丰度的差异。图c显示纤维化肺组织中，不同链长的糖原在丰度上都有升高。

　　图d为多变量分析结果，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对比两组之间糖原和N-聚糖差异。图e则以热图展示了两组间得分排列前25的糖原和N-聚糖差异。图f为多参数受试者工作特征曲线（Multivariate receiver operating characteristic,ROC），表明区分两组之间差异的可信度。

　　图g-j显示出几种N-聚糖代谢物在正常和纤维化肺组织样本中存在差异，包括m/z=1809的代谢物空间分布和总量对比（图g），以及m/z=1485（图h）、m/z=2012（图i）、及m/z=2122的代谢物差异（图j）。

　　图4.博莱霉素诱导小鼠肺纤维化发现糖原代谢异常特征

　　图4a显示博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型示意图，诱导14天后可导致纤维化的发生。图b显示对照组和博莱霉素组的病理切片，显示肺纤维化诱导的成功。

　　图c和d显示了三种N-聚糖代谢物在对照组和博来霉素组之间的空间分布差异，包括m/z=1809、m/z=1485、m/z=2012三种代谢物的分布对比，统计发现m/z=2012的N-聚糖代谢物在两组之间的丰度差异较为明显。

　　图e显示糖原代谢后的7碳产物(1175 m/z)在对照组和博莱霉素组之间的空间分布差异。

　　图f显示博来霉素组的多种糖原代谢产物在丰度上都明显超过对照组。

　　图g显示对照组的总糖原丰度明显低于博来霉素组。

　　图h为糖原和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫荧光/共定位实验结果，显示肺纤维化区域糖原富集于肌成纤维细胞群。糖原（红色）、α-SMA（绿色）、DAPI（蓝色）。

 

　　图i卡通图总结人类肺纤维化与小鼠肺纤维化过程中均有糖原和N-聚糖代谢异常升高。

　　图5.基因缺陷小鼠诱导肺纤维化

　　证实磷酸酶的缺乏会减弱其中的糖原代谢

　　图5a展示利用一种Epm2a基因敲除型小鼠（LKO）开展肺纤维化诱导实验的示意图。

　　图b显示四组小鼠在实验期间的体重变化。

　　图c对比分析了野生型和LKO型两组肺纤维化小鼠之间的生存率。

　　图d显示糖原代谢后的7碳产物(1175 m/z)在4组小鼠肺部样本切片之间的分布差异。

　　图e展示了多种糖原代谢产物在4组小鼠肺部样本切片之间的对比。

　　图f展示了总糖原丰度在4组小鼠肺部样本切片之间的对比。

　　图g显示了4组小鼠肺组织病理切片的代表性图像。

　　图h对比分析了4组小鼠肺组织病理评分（Ashcroft评分法）的统计结果。

　　图i对比分析了4组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中总胶原蛋白含量（与肺纤维化程度相关）的检测结果，显示LKO组小鼠更低。

　　图j显示利用质谱成像技术检测切片中胶原蛋白空间分布的技术示意图。

　　图k展示了胶原蛋白的酶解产物（m/z=1247，m/z=843）在4组小鼠肺组织切片上的空间分布差异。

　　图6.机制研究发现肺纤维化与溶酶体降解糖原途径有关
　　图6a和b分别展示了肺纤维化样本中，糖原和溶酶体共定位的免疫荧光实验结果。

　　图a利用了溶酶体的代表性标记物酸性α-葡萄糖苷酶（GAA），检测人肺纤维化样本；图b利用了溶酶体的另一个标记物溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)，检测小鼠肺纤维化样本。糖原（红色）、GAA（绿色）、LAMP2（绿色）、DAPI（蓝色）染色。

　　图c卡通图显示溶酶体中GAA酶解糖原，为其他糖类提供底物的过程。

　　图d卡通图显示利用Gaa基因敲除小鼠（GKO）开展博来霉素诱导肺纤维化实验流程。

　　图e显示四组小鼠的病理切片，显示肺纤维化诱导结果。图f对比分析了4组小鼠肺组织病理评分（Ashcroft评分法）的统计结果。

　　图g展示了多种糖原代谢产物在4组小鼠肺部样本切片之间的对比。图h展示了总糖原丰度在4组小鼠肺部样本切片之间的对比。

　　图i展示了GKO小鼠诱导肺纤维化实验中，4组样本切片中N-聚糖两种代谢物的丰度差异（m/z=1444，m/z=2012）。图j则展示了LKO小鼠诱导肺纤维化实验中，4组样本切片中N-聚糖两种代谢物的丰度差异（m/z=1444，m/z=2012）。

　　图k卡通图展示在博来霉素诱导肺纤维化进程中，溶酶体代谢糖原的途径起到重要作用。

 

　　06总结与启发

　　本文基本研究内容强调了空间代谢分析在临床组织病理中的应用，由于临床FFPE样本的广泛使用，有关质谱成像的新技术在分析并提供生物标记物方面展现了极广泛的应用前景。

　　该研究揭示，肺纤维化患者的临床切片具有糖原丰度增高现象，糖原与溶酶体标记物GAA和LAMP2的共定位分析，证实了溶酶体参与了肺纤维化过程中的糖原利用，推测抑制糖原利用在肺纤维化（PF）发展过程中具有临床意义。

　　从这篇影响因子16分NC文献，可以学习到：

　　1.文章共6个大图，含67个左右的panel，表明了目前NC期刊所需求的数据量；

　　2.空间代谢相关分析贡献了近60个左右的panel，占比超过85%，充分说明灵活的数据分析的重要性；

　　3.充分展现了FFPE样本结合空间代谢的潜力，临床拥有丰富FFPE样本，质谱成像保留了解剖原位信息，避免了冗长且丧失结构信息的细胞分离步骤，也避免了收集新鲜组织的额外工作，可以贡献大量的亚细胞病理特征。

　　4.华测艾研多组学研究中心推出空间代谢组学科研服务，不仅可以辅助客户科研项目，在数据分析和制作图表方面一步到位；而且可以对接真实临床需求，辅助客户进行临床转化。

　　参考文献
　　Lindsey R C,Harrison A C,Derek B A,et al.Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis.Nat Commun.2023 May 13;14(1):2759.doi:10.1038/s41467-023-38437-1.