世界肝炎日 | 研究非酒精性脂肪肝病，揭秘肠肝轴在其发展中的重要作用

　　今天7月28日是第13个世界肝炎日，世卫组织将主题定为“坚持早预防，加强检测发现，规范抗病毒治疗”。目前，全球约有3.25亿人患有肝炎相关疾病，每30秒就有一人死于肝炎相关疾病。关注肝脏健康，刻不容缓。

　　非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种以肝细胞脂质堆积为特征的综合性临床疾病，包括简单脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）以及肝纤维化和肝硬化。在中国，NAFLD正在取代乙型肝炎，成为慢性肝病的主要原因。

　　肠道-肝脏轴在酒精性肝病、NAFLD和肝细胞癌等肝脏损伤的发病机制中起着重要作用。肠道微生物群落也被发现对人体健康至关重要，其关键功能已通过临床前NAFLD/NASH模型和NASH患者得到认证。

 

　　01研究目的

　　目前还没有被FDA批准的药物来治疗或预防NAFLD，奥贝胆酸（OCA）是一种新的胆汁酸衍生物，已被证明可以改善与NAFLD相关的表征。

　　考虑到肠-肝轴在肝病发展中的作用，本研究旨在探索对于高脂饮食（HFD）诱导的NAFLD小鼠，其肠道菌群在OCA治疗时发挥的潜在作用。

 

　　02研究方法

　　66只6周大的小鼠平均分成6组（每组11只），并随机分配为正常饮食组（对照组）、HFD组（高脂饮食）、HFD+OCA组（高脂饮食并接受OCA治疗）、HFD+A（高脂饮食并接受抗生素干预）、HFD+A+OCA（高脂饮食并接受抗生素干预和OCA治疗）和FMT（粪便菌群移植）。

　　实验周期为20周，OCA治疗的标准为每天一次口服OCA（50mg/kg体重）；FMT为从HFD+OCA组的小鼠中获取粪便菌群并移植到经过12周HFD后的小鼠。

　　通过对生化指标、宏基因组结果、靶向代谢组学结果进行相关分析，评估差异菌种、菌种丰度与胆汁酸的相关性、菌群基因组参与编码胆汁酸代谢相关酶的潜在可能性。

　　分析方法：

　　（1）监测生化指标、炎症因子和肠道屏障功能（肠末端组织蛋白表达水平）。

　　（2）对小鼠肠道菌群进行宏基因组测序，并基于基因组组装方法注释微生物组成及丰度。

　　（3）对小鼠血清和粪便样本中胆汁酸的进行靶向代谢组学分析。

　　（4）采用了T-test、one-way ANOVA、Wilcoxon rank-sum test等统计方法检验相关性，使用LEfSe对宏基因组结果进行差异分析，使用Spearman相关分析对靶向代谢组学结果进行相关性分析。

 

　　03研究结果

　　图1：表明肠道菌群在接受OCA治疗的NAFLD小鼠中起着关键作用

　　图1A：HFD对小鼠的体重影响很大。与ND组小鼠相比，HFD组小鼠的体重从第四周到实验结束时一直显著增加（P<0.01，T-test）。

　　图1B：对于HFD组，OCA治疗（HFD+OCA组）显著降低了体重（P<0.01，T-test）。而经过10周HFD后和2周抗生素诱导的肠道菌群消减（AIMD）的小鼠（HFD+A组）和随后接受OCA治疗的小鼠（HFD+A+OCA组）与HFD组小鼠相比明显降低了体重。

　　图1C：HFD组小鼠的肝脏重量与体重之比显著高于ND组小鼠，AIMD、OCA治疗和FMT可以降低HFD组小鼠的比值并恢复到与ND组小鼠相当的水平。

　　图1D：对小鼠肝脏组织进行苏木精-伊红（HE）染色和油红O（oil red O）染色发现，HFD可能对肝脏产生组织病理效应。与ND组小鼠相比，HFD组、HFD+OCA组、HFD+A组、HFD+A+OCA组和FMT组的肝细胞水肿明显，肝细胞和细胞核边缘显著增大。HFD组、HFD+A组和HFD+A+OCA组的肝细胞中可见明显脂滴，表明这三组小鼠的肝脏脂肪积累严重。

　　图1E：在HE染色的脂肪组织中，所有经过HFD的小鼠（HFD组、HFD+A组、HFD+A+OCA组、FMT组）的脂肪细胞大小均明显大于ND组小鼠，而HFD组的脂肪细胞大小与HFD+A组、HFD+A+OCA组相似，但显著大于HFD+OCA组和FMT组。

　　图1F、G：与ND组小鼠相比，HFD损害了小鼠的肝脏功能，而OCA治疗和FMT能显著恢复HFD小鼠受损的肝功能。与ND组小鼠相比，HFD组小鼠血清中的ALT（谷丙转氨酶）和AST（谷草转氨酶）水平显著升高，而在经过OCA治疗和FMT后得到有效降低。（ALT和AST分别叫谷丙转氨酶和谷草转氨酶，是诊断肝脏功能是否异常的最常用的指标）。

　　图2：OCA治疗对非酒精性脂肪肝病（NAFLD）小鼠肠道菌群组成的影响

　　图2A：在α多样性方面，肠道菌群的Shannon指数和Simpson指数在三组小鼠中表现出一致变化趋势，但并没有显著差异。

　　图2B、C：在种水平上，进行基于Bray-Curtis距离矩阵的NMDS分析和主成分分析（PCA）。结果显示ND组、HFD组和HFD+OCA组之间的微生物群落存在显著差异（adonis R2=0.243，P=0.001，permutational multivariate ANOVA）。

　　图2D、F：在属水平上，与HFD组相比，ND组小鼠肠道中富集的细菌包括Akkermansia、Mucispirillum、Helicobacteria、Parabacteroides、Oscillibacter、Parasutterella、Subdoligranulum、Bifidobacterium和Dorea。

　　图2E、G：在属水平上，与HFD组相比，HFD+OCA组小鼠肠道中富集的细菌包括Akkermansia、Bifidobacterium、Bacteroides、Escherichia、Streptococcus、Olsenella、Collinsella、Lactococcus和Parasutterella。

　　图2H：在种水平上，与HFD组相比，HFD+OCA组小鼠肠道中Lactobacillus murine、Firmicutes bacterium M10-2、Lactobacillus gasseri、Enterococcus faecium的丰度显著减少。与HFD组相比，ND组小鼠肠道中的A.muciniphila、Mucispirillum schaedleri、Parasutterella excrementihominis、B.pseudolongum、Bacteroides uniformis、Bacteroides xylanisolvens的丰度升高。

　　图2I：在种水平上，与HFD组相比，HFD+OCA组中Akkmansia muciniphila、Bifidobacterium animalis、Bacteroides massiliensis、Alistipes senegalensis、Bacteroides thetaiotaomicron、Bifidobacterium pseudolongum、Escherichia coli、Blautia producta、Parabacteroides distasonis、Alistipes indistinctus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus delbrueckii、Streptococcus thermophilus、Lactococcus lactis和Parasutterella excrementihominis的丰度升高。

　　图3：胆汁酸结果显示胆汁酸与肠道菌群之间的相关性

　　肠道菌群与胆汁酸代谢密切相关，肠道菌群的变化可能会影响宿主的总胆汁酸池。

　　图3A：胆汁酸靶向代谢组学分析结果表明，HFD组和HFD+OCA组都能有效地改变小鼠血清中的胆汁酸池。与ND组相比，HFD组小鼠血清中的结合型胆汁酸（如TCDCA、THDCA和TUDCA）水平显著升高，而非结合型胆汁酸（如CA和CDCA）水平降低。

　　图3B：与HFD组相比，HFD+OCA组小鼠血清中的CA、CDCA、HDCA和UDCA的水平显著降低。

　　图3C：与ND组相比，HFD组小鼠粪便中胆汁酸水平显著升高（P<0.05，Wilcoxon rank-sum test）。

　　图3D：HFD组小鼠在经过OCA治疗后粪便中胆汁酸水平大多数都降低，包括结合型胆汁酸（如GDCA和GUDCA）的水平。

　　图3E、F：在ND、HFD和OCA组的菌种丰度和血清中胆汁酸水平之间进行了Spearman相关性分析。结果显示B.massiliensis、A.muciniphila、L.johnsonii和L.reuteri等菌种的丰度与血清中TCDCA、THDCA和TUDCA的水平呈正相关，并且除了A.muciniphila外上述其他菌种都与HDCA的水平呈显著负相关。此外，E.coli与血清中HDCA、CDCA和CA的水平呈显著负相关。

　　图3G、H：同时分析了菌种丰度和粪便中胆汁酸水平的相关性。结果显示L.murinus和L.gasseri的丰度与粪便中TDCA、TUDCA和TCDCA的水平呈显著正相关；A.muciniphila的丰度与粪便中TCDCA、THDCA和TUDCA的水平呈显著负相关。此外，B.pseudolongum与血清及粪便中的TDCA和TUDCA均呈负相关。A.muciniphila和S.thermophilus均与粪便中的THDCA呈正相关，而L.gasseri与其呈负相关。

　　图4：细菌基因组编码胆汁酸代谢相关酶的潜在可能

　　图4A：对于富集在不同组（HFD组vs ND组，HFD组vs OCA组）之间的种水平基因组bins（SGBs）进行了酶相关基因组扫描。与HFD组相比，主要富集在ND组的SGBs包括：Bacteroides属下的菌种、Parabacteroides、Prevotellacea、Bifidobacterium pseudolongum、Alistipes indistinctus、Clostridium innocuum。

　　图4B：OCA治疗使Bacteroides属下的两种菌、Prevotellaceae属下的两种菌、Bifidobacterium pseudolongum、Alistipes indistinctus、Escherichia_coli和Proteus mirabilis的丰度显著增加。与HFD+OCA组相比，在HFD组中富集的细菌仅属于Firmicutes门。

 

　　04研究结论

　　（1）证实了肠道菌群对OCA治疗NAFLD的至关重要性，能够有效恢复因HFD受损的肝功能。（上图展示门水平上ND组、HFD组和HFD+OCA组的肠道菌群组成差异）

　　（2）OCA通过降低胆酸（CA）和鹅脱氧胆酸（CDCA）的含量、增加牛磺脱氧胆酸（TDCA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的含量来调节宿主的胆汁酸池。不同菌群与不同的胆汁酸之间存在显著相关性。

　　（3）HFD使参与编码胆盐水解酶（BSHs）的菌种丰度增加，从而加速了胆汁分泌到肠道、结合型胆汁酸解离为初级胆汁酸的过程。

　　而OCA治疗使可能参与编码7α-羟基酸脱氢酶（7α-HSDs）的菌种丰度增加，有助于初级胆汁酸的降解、促进肠道次级胆汁酸的生物转化。OCA干预后富集的菌群基因组在编码7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDs）产生次级胆汁酸方面表现出潜力。

 

　　05总结与启发

　　非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种与多因素相关的疾病，具有复杂的发病机制，本研究结合宏基因组和代谢组的分析结果，通过挖掘特异菌群和靶向代谢物群，为探索肠道微生物在疾病发生机制和药物作用机理中发挥的作用提供了新的见解，并为通过肠道微生物预防和治疗复杂疾病奠定理论基础。

　　华测艾研多组学研究中心具有丰富的高通量测序-微生物组学（宏基因组等）、代谢组学科研服务经验，可以辅助客户科研项目，在数据分析和制作图表方面一步到位；实现多组学联合分析，赋能高分文章，辅助推进临床转化。

　　参考文献
　　Gut microbiome determines therapeutic effects of OCA on NAFLD by modulating bile acid metabolism
　　doi:10.1038/s41522-023-00399-z
　　Published:31 May 2023
　　发表刊物：NPJ Biofilms and Microbiomes[IF：8.462]