文献解读 | 多组学分析揭秘肠易激综合征的微生物群及其排便习惯亚型

　　肠易激综合征（IBS）是最常见的肠-脑互动异常疾病之一，也被称为功能性胃肠道疾病。目前IBS主要定义为在无解剖、炎症或生化病理的情况下，产生反复腹痛并伴有排便习惯与性状的改变。根据排便习惯可将其分为四种亚型：腹泻型（IBS-D）、便秘型（IBS-C）、混合型（IBS-M）和不确定型（IBS-U）。

　　本次将分享一篇2023年1月发表在Microbiome（IF 16.837）上的文章，主要通过多组学分析来探究IBS的微生物群以及排便习惯亚型。

 

　　01 研究目的

　　IBS被认为与肠道微生物群的改变有关，但其微生物特征一直难以确定。以往研究主要集中在微生物的组成上，为了进一步了解IBS肠道微生物的功能特性，本研究结合16S、宏转录组学和代谢组学进行微生物功能的多组学评估，从而进一步描述IBS的微生物谱及其排便习惯亚型。

　　02 研究方法

　　研究招募318名IBS患者和177名健康对照（HC），利用16S rRNA基因测序（n=486）、宏转录组测序（n=327）和非靶向代谢组检测（n=368）技术对肠道微生物组进行多组学分析。

　　本研究微生物的组成基于16S rRNA基因和宏转录组物种分类后的相对丰度评估，微生物的功能特性基于16S rRNA基因进行功能预测为KEGG同源物（KOs）的细菌基因家族丰度（预测的宏基因组）和宏转录组进行功能注释为KOs的转录本丰度以及粪便代谢物水平评估。

　　具体研究方法如下：
　　1. 结合年龄、性别、种族/民族、BMI、饮食和焦虑情绪的多变量模型，鉴定IBS中有差异丰度的微生物、预测基因、转录本和代谢物。
　　2. 通过转录本/基因比值和微生物代谢模型来评估多组学间的功能关系。
　　3. 利用差异特征构建随机森林分类器。

　　03 研究结果

 

　　图1 探究IBS状态是否和微生物组成和功能的改变有关
　　图1表明，IBS与微生物组组成和功能的整体改变有关。

　　图1A显示，通过非参数检验和多元线性模型，IBS和HC两组香农指数（alpha多样性指标）无明显差异。研究分别计算IBS和HC在16S物种分类、预测的宏基因组（PM）、宏转录组物种分类（MT-T）、KEGG同源转录本注释（MT-KO）和归一化代谢组学数据（MET）的beta多样性，之后结合协变量进行PERMANOVA分析发现，IBS状态与IBS和HC之间所有微生物组成和功能指标的改变都显著相关（图1B）。

　　经过回归了年龄、性别、种族/民族、BMI、饮食和焦虑情绪6个协变量的PERMANOVA分析发现，IBS状态仍然与16S、PM、MT-T和MT-KO的改变显著相关，但不再与代谢组有显著关联（图1B，C）。

 

　　图2 各组学中IBS的微生物差异特征

　　图2表明，IBS的特征是细菌分类群、粪便代谢物和转录本丰度的改变，包括涉及低聚果糖利用的基因。

　　研究使用16S 物种分类（图2A）和宏转录组物种分类（图2B）相对丰度构建多变量模型，确定了IBS和HC之间存在显著丰度差异的细菌分类群（如Bacteroides dorei）。

　　图2C展示了IBS和HC存在显著丰度差异的粪便代谢物，结果显示在IBS中酪胺增加，龙胆酸和肉桂酸减少等。之后比较宏转录组KOs的转录本丰度，发现IBS中出现16个增加和3个降低的细菌转录本，主要涉及低聚果糖和多元醇利用（图2D）。

 

　　图3 各组学之间的关系

　　图3表明，经过细菌分类和功能的组学间比较，IBS中参与碳水化合物发酵的琥珀酸途径的转录本表达上调。

　　鉴定了IBS分别在各组学上的微生物特征之后，研究又探究了物种组成在多组学之间的相关性，图3A显示了16S和宏转录组物种分类后相同菌属的相对丰度分别在IBS和HC两组的相关性散点图，其中322例样本同时具有这种两组学的数据，取其相对丰度的中位数参与相关性分析，以下同理。

　　图3B显示了IBS与HC之间在宏转录组（RNA）和16S（DNA）物种分类后相同菌属相对丰度比值（RNA/DNA Genera）的相关性散点图。比较IBS和HC，可发现两组在属水平上具有相似的微生物转录活性模式，相关性很高。图3C显示了预测的宏基因组KOs的基因丰度与宏转录组KOs的转录本丰度之间分别在IBS和HC组的相关性散点图。

　　图3D则显示了IBS和HC组之间宏转录组KOs的转录本和预测的宏基因组KOs的基因丰度比值（RNA/DNA KO）的相关性散点图，虽然IBS和HC之间的RNA/DNA KO高度相关，但在回归了协变量后，发现KOs在IBS和HC之间中有182个存在差异调控，图中有颜色的散点表示与HC相比，在IBS中显著上调或下调的转录本。

　　图3E显示，通过通路富集分析发现在IBS与HC相比显著上调的21个转录本富集在柠檬酸循环、果糖和甘露糖代谢、原核生物中的碳固定化和氨酰基tRNA生物合成的途径。综合来看，柠檬酸循环和原核生物中的碳固定化两种途径中的转录本几乎涵盖了碳水化合物发酵为丙酸酯的琥珀酸途径中的所有酶。图3F显示了碳水化合物发酵的琥珀酸途径，蓝色表示IBS转录上调的酶。

 

　　图4 探究单组学和多组学特征对IBS的鉴定潜力

　　图4表明，与使用单组学特征训练的分类器相比，IBS的微生物多组学分类器显示出更高的准确性。

　　图4A显示了使用单组学和多组学特征训练的随机森林分类器对于IBS和HC分类的ROC曲线，多组学分类器显示出最高的准确性（AUC=0.82），其中多组学特征建立在IBS和HC之间存在差异的指标上，包括在富集通路上存在差异的基因标准化转录本丰度（转录本/基因比值）、在宏转录组和预测的宏基因组中都存在差异的转录本丰度、以及与微生物代谢潜力相关并存在差异的代谢物丰度。

　　图4B显示了在随机森林分类器中多组学特征的重要性得分排名，可以看到贡献最大的三个多组学特征分别是代谢物：龙胆酸盐、氢肉桂酸盐和酪胺。

 

　　图5 探究IBS排便习惯亚型是否与微生物组成和功能有关
　　图5 表明IBS亚型之间在宏转录组和代谢组学具有不同的功能特征。

　　在探究IBS的相关微生物特征后，研究随后评估了微生物组成和功能与IBS排便习惯亚型之间的关系。结果发现，排便习惯与宏转录组的功能注释和代谢组学的改变显著相关，但与微生物组成和预测的宏基因组无关（图5A，B）。

 

　　图6 探究IBS亚型之间的微生物功能差异特征

　　图6表明，IBS-D表现出相对于IBS-C的丙酸代谢、萜类生物合成、果糖和甘露糖代谢以及糖酵解相关基因转录上调特征。

　　研究进行各个亚型之间的比较，发现了IBS-D和IBS-C之间的变化规律。图6A显示了在IBS-D和IBS-C中差异调控转录本中显著富集的途径。

　　IBS-D与IBS-C相比共有140个转录本在转录本/基因比值上显著变化，其中128个表达上调，包括胆汁酸、多胺、琥珀酸途径中间体（苹果酸、富马酸）以及参与果糖、甘露糖和多元醇代谢转录本，颜色表示通路，点的大小与转录本/基因比值成正比。

　　图6B显示了IBS-D和IBS-C患者的在转录本/基因比值的相关性散点图，结果显示出强相关。

 

　　图7 探究单组学特征和多组学特征对于IBS亚型的鉴定潜力
　　图7表明，代谢物、转录本和转录本/基因比值可以区分IBS-D和IBS-C。

　　图7A中，蓝色表示多组学特征，红色表示单组学特征进行随机森林分类器分类后的ROC曲线，多组学分类的性能最高，AUC为0.86。宏转录组学KOs和代谢物构建的分类器AUC均为0.79，并且与多组学分类方法没有明显差异。其中多组学特征由在富集通路中显著上调的转录本/基因比值和微生物群落代谢潜力相关的差异代谢物构成。

　　图7B-D分别显示了宏转录组、代谢组和多组学特征在随机森林分类器中重要性得分的排列，颜色表示IBS-D与IBS-C相比的上调或下调。

　　04 研究结论

　　研究表明，IBS具有多组学微生物特征，提示其利用可发酵碳水化合物的能力增加，同时也发现了一些新的代谢物和代谢通路。相关通路的进一步研究有助于阐明IBS病理生理学的机制和理解微生物组导向的IBS治疗策略。

　　此外，IBS排便习惯亚型表现出强烈的功能分化，表明微生物代谢活动在决定IBS排便习惯改变中起着关键作用。研究结果支持了对微生物功能进行整合评估的必要性，以确定影响IBS症状产生和可能涉及的相关途径。

　　05 总结与启发

　　这篇文章从多组学数据出发，研究了IBS肠道微生物的功能特性，并且构建的代谢物和转录本的多组学分类器在IBS及其亚型分类中能够达到较为准确的分类效果。

　　可以看出，目前微生物组相关文章已逐渐从研究其物种组成，深入到探究其功能变化；从多组学物种组成关系的研究，深入到多组学功能特性关系的探索。

　　总体上，相关研究运用多组学的手段，进行不同组学之间的相互补充和验证，来尝试发掘和阐明蕴含在生理学背后的作用路径和机制。在疾病研究方面，使用多组学分析也成为能够发现潜在治疗靶点的重要手段。

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　　参考文献
　　[1] Jacobs J P, Lagishetty V, Hauer M C, et al. Multi-omics profiles of the intestinal microbiome in irritable bowel syndrome and its bowel habit subtypes[J]. Microbiome, 2023, 11(1): 5.