文献解读 | 代谢流解析中药成份的作用机制

　　丹参是一种常用的中药材，含有多种化学成分，包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类化合物，这些成分赋予了丹参广泛的药理作用，如抗动脉粥样硬化、防治脑血栓、抗肿瘤、保护心肌和肝脏等。已知其中的丹参酮IIA（Tan IIA）可以抑制活性氧介导的肌成纤维细胞活化，显示出抗纤维化作用。

　　本研究旨在探索Tan IIA如何影响谷氨酰胺在细胞内的代谢，进而对肺纤维化的进程产生影响。

　　01研究方法

　　研究首先采用多种实验方法来验证肺纤维化特征，检验细胞增殖情况。继而使用稳定同位素C13标记的谷氨酰胺为示踪剂，以代谢流技术来追踪谷氨酰胺在细胞内的代谢通路，评估丹参酮IIA对这些通路的影响。

　　文章利用了INCA软件程序，以准确定量谷氨酰胺分解、脯氨酸合成和TCA循环途径的绝对代谢通量，从而分析和量化细胞内代谢网络的动态。

　　此外还使用了分子对接技术来分析识别丹参酮IIA与潜在蛋白的结合，以在分子层面解释其如何影响代谢途径。

　　02研究结果

　　研究表明丹参酮IIA对肺纤维化具有显著的改善作用，减轻了TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖，降低胶原蛋白I和III以及α-SMA蛋白的表达。

　　通过代谢流技术分析发现，其主要通过调节谷氨酰胺代谢重编程来实现这一效果，谷氨酰胺进入线粒体后主要用于脯氨酸的生物合成，而不是TCA循环，Tan IIA通过抑制P5CS、PYCR1和PSAT1的表达，减少了脯氨酸的羟基化，阻断了胶原蛋白合成途径。

　　此外Tan IIA还调节了线粒体能量代谢，通过影响TGF-β1刺激的谷氨酰胺代谢重编程，抑制了谷氨酰胺酶（GLS1）的表达，从而减少了谷氨酰胺进入线粒体的代谢通量。

　　03研究结论

　　研究通过创新性地应用代谢流技术，指出丹参酮IIA能有效逆转肺纤维化的谷氨酰胺代谢重编程，研究精确测量了谷氨酰胺在细胞内的代谢路径，揭示了Tan IIA抗纤维化的分子机制。

　　通过减少谷氨酰胺进入代谢，抑制相关代谢酶的表达，减少脯氨酸的羟基化，阻断胶原蛋白合成，从而减轻了肺纤维化。

　　这些结论证实了丹参酮IIA在治疗肺纤维化方面的潜力，也为未来通过调节代谢途径来治疗疾病提供了新型策略。

　　04研究结果展开

　　图1.描述了谷氨酰胺对TGF-β1诱导的细胞增殖和胶原蛋白蛋白产生的影响，主要实验包括细胞培养给药（NIH-3T3和MRC-5）、EdU掺入、IF、WB，展示谷氨酰胺在TGF-β1诱导的细胞增殖和胶原蛋白合成中的重要性，以及通过抑制谷氨酰胺代谢途径对这些过程的潜在调控作用。

　　A.谷氨酰胺促进了TGF-β1（10 ng/mL）诱导的NIH-3T3细胞的增殖。B.谷氨酰胺增加了TGF-β1（10 ng/mL）诱导的NIH-3T3细胞中EdU阳性比例。C和D.WB分析显示，在TGF-β1（10 ng/mL）诱导下，不同浓度谷氨酰胺对NIH-3T3细胞中GLS1、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白III和α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）蛋白表达水平的影响。E和F.WB分析显示，在TGF-β1（10 ng/mL）诱导下，谷氨酰胺酶抑制剂CB-839对NIH-3T3细胞中各蛋白marker表达水平的影响。G.WB分析显示，在TGF-β1（10 ng/mL）诱导下，谷氨酰胺酶抑制剂CB-839对MRC-5细胞中各蛋白marker表达水平的影响。

　　图2.通过WB和IF实验展示Tan IIA如何通过抑制GLS1的表达来减少TGF-β1诱导的胶原蛋白产生

　　A.WB实验结果显示Tan IIA（10µM）和SFN（5µM）对TGF-β1（10 ng/mL）刺激NIH-3T3细胞表达胶原蛋白I和III蛋白的影响。SFN为Nrf2通路激活剂，此处用作对照，来对比TGF-β1诱导纤维化胶原蛋白合成的变化。B.WB实验结果显示Tan IIA和SFN对TGF-β1刺激MRC-5细胞表达胶原蛋白I和III蛋白的影响。C.胶原蛋白生物合成途径示意图，GLS1是谷氨酰胺代谢途径中的关键酶。D.IF实验观察Tan IIA对GLS1蛋白表达的影响，绿色（GLS1），蓝色（细胞核）。E.WB实验结果显示Tan IIA（10µM）和CB-839（2.5µM）对TGF-β1（10 ng/mL）诱导的NIH-3T3细胞中GLS1、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白III和a-SMA蛋白表达的影响。F.对于E结果的量化统计分析。

　　图3.主要描述了Tan IIA对TGF-β1诱导的谷氨酰胺消耗和代谢通量的影响

　　A.展示了通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）在NIH-3T3细胞中检测到的糖酵解和三羧酸（TCA）循环代谢产物的相对丰度，在用Tan IIA处理12小时后的变化。这结果反映了Tan IIA对细胞代谢途径的影响。B.提供了[U-13C5]-谷氨酰胺在NIH-3T3细胞中的标记示意图。这个示意图说明了[U-13C5]-谷氨酰胺如何被用来追踪细胞内代谢途径的动态变化。C.展示了12C谷氨酰胺和[U-13C5]-谷氨酰胺的TBDMS衍生物的质谱图。这结果用于验证[U-13C5]-谷氨酰胺标记的成功和代谢物的检测。D.提供了[U-13C5]-谷氨酰胺代谢的示意图。这个图示说明了[U-13C5]-谷氨酰胺在细胞内如何被代谢，以及它如何参与到TCA循环和其他代谢途径中。E.展示了在2 mM[U-13C5]-谷氨酰胺存在下，通过GC-MS测量的直接来源于谷氨酰胺的代谢产物在指定时间点的变化。这数据反映了谷氨酰胺代谢通量随时间的变化情况。F.展示了[U-13C5]-谷氨酰胺进入指定代谢产物的追踪图。这个图表显示了总代谢物池大小相对于细胞体积的标准化数据，反映了Tan IIA和CB-839对TGF-β1诱导的代谢变化的影响。

　　图4.通过代谢流分析，提供了Tan IIA如何通过调节特定的代谢途径来影响细胞代谢状态的证据。描述了Tan IIA对TGF-β1诱导的细胞代谢通量的影响，特别是在TCA循环和脯氨酸合成途径中的作用。

　　A.展示了使用质量分布向量（Mass Distribution Vector,MDV，也称为质量分布，Mass Isotopomer Distribution,MID）分析的结果。MDV是描述标记模式的一种方式，由每种质量同位素的相对丰度组成。这结果反映了[U-13C5]-谷氨酰胺在Tan IIA处理下NIH-3T3细胞中m+5标记的代谢物（包括谷氨酸和α-酮戊二酸）的显著减少，与CB-839处理的效果相似，表明Tan IIA通过抑制GLS1的表达来抑制谷氨酰胺分解。B.进一步分析了来自[U-13C5]-谷氨酰胺的TCA循环中m+4标记的代谢物（包括延胡索酸、苹果酸、柠檬酸和天冬氨酸）在Tan IIA处理后的MDV变化。结果观察到与A类似的减少趋势，说明Tan IIA对TCA循环的代谢通量有抑制作用。C.分析了TGF-β1诱导的NIH-3T3细胞中谷氨酰胺的摄取率和谷氨酸的分泌率。结果显示，与正常细胞相比，TGF-β1诱导的细胞消耗更多的细胞外谷氨酰胺，而CB-839或Tan IIA的添加降低了这种消耗。同时，TGF-β1诱导的细胞分泌更多的细胞外谷氨酸，而CB-839或Tan IIA处理降低了这种分泌。这些发现表明Tan IIA抑制了TGF-β1诱导的细胞中显著增加的谷氨酰胺分解。

　　图5.通过结合代谢途径示意图、细胞代谢物摄取和分泌率的测定以及代谢通量的定量分析，全面展示了Tan IIA如何通过调节谷氨酰胺代谢来抑制TGF-β1诱导的代谢重编程，进而可能影响胶原蛋白的合成和肺纤维化的进程。主要描述了Tan IIA对谷氨酰胺代谢途径的影响，以及它如何通过减少代谢通量来干预TGF-β1诱导的代谢重编程。

　　A.展示了在哺乳动物细胞中谷氨酰胺代谢的主要途径的示意图。这一可能包括了谷氨酰胺通过不同代谢途径转化为其他重要代谢产物的过程，如通过谷氨酰胺酶(GLS1)转化为谷氨酸，进而参与到TCA循环或脯氨酸的合成等。B.描述了在NIH-3T3细胞中谷氨酰胺的摄取率和谷氨酸的分泌率。这一可能包含了实验数据，展示了Tan IIA或CB-839处理对细胞摄取谷氨酰胺和分泌谷氨酸的影响，以及这些变化如何反映TGF-β1诱导的代谢变化。C.通过代谢流分析，展示了在NIH-3T3细胞中Tan IIA对谷氨酰胺代谢途径的影响，以卡通图形式对比了四个组别的异同。这一可能包含了通过整合谷氨酰胺摄取率、谷氨酸分泌率以及[U-13C5]-谷氨酰胺示踪实验得到的同位素标记数据，定量分析了Tan IIA或CB-839如何改变谷氨酰胺碳进入α-酮戊二酸(a-KG)和脯氨酸生物合成的通量。

　　图6.主要描述Tan IIA如何通过抑制脯氨酸合成的关键酶来减少胶原蛋白的产生

　　A.展示了线粒体脯氨酸和α-酮戊二酸（a-KG）生物合成途径的示意图。这一说明了谷氨酰胺衍生的谷氨酸是如何在线粒体中经过两个步骤转化为脯氨酸的。B.通过WB分析，展示了Tan IIA对TGF-β1（10 ng/mL）诱导的NIH-3T3细胞中GLS1、PSAT1、P5CS和PYCR1蛋白水平的影响。C.通过WB分析，展示了Tan IIA对TGF-β1（10 ng/mL）诱导的MRC-5细胞中GLS1、PSAT1、P5CS和PYCR1蛋白水平的影响。D.IF实验评估了Tan IIA对P5CS（绿色）表达的影响，细胞核用DAPI（蓝色）染色。E.IF实验评估Tan IIA对PYCR1（绿色）表达的影响，细胞核用DAPI（蓝色）染色。F.IF实验评估了Tan IIA对PSAT1（绿色）表达的影响，细胞核用DAPI（蓝色）染色。G.WB实验显示抑制GLS1并补充a-KG可以增加胶原蛋白表达。H.WB实验显示Tan IIA（10µM）抑制胶原蛋白表达，而通过补充外源性a-KG可以逆转这一抑制作用。I.展示了Tan IIA与GLS1、PSAT1、P5CS和PYCR1的分子对接模型，说明了Tan IIA如何与这些靶标蛋白结合。

　　图7.描述Tan IIA改善TGF-β1诱导的谷氨酰胺代谢重编程并阻断胶原蛋白合成途径的机制模型图

　　在图中描述了：1.TGF-β1的作用，其促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，这是肺纤维化过程中的关键步骤；2.谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶（GLS1）的作用被转化为谷氨酸，进入谷氨酰胺分解途径；3.谷氨酸进一步转化为α-酮戊二酸（α-KG），参与到三羧酸（TCA）循环中，为细胞提供能量和生物合成的前体；4.α-KG在线粒体中通过P5CS（δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶）和PYCR1（吡咯啉-5-羧酸还原酶）的作用转化为脯氨酸，是胶原蛋白合成的重要氨基酸；5.图中列出代谢物的丰度变化（如88.29、67.55、39.15、32.17等），表示Tan IIA处理前后代谢物水平的变化；6.Tan IIA通过影响上述代谢途径来减少胶原蛋白的合成是抗纤维化机制。

　　05总结与启发

　　该篇文献发表于J Adv Res.（IF>11），研究结合了中药成分（丹参酮IIA）和现代代谢分析技术，突出了代谢流分析在理解复杂疾病如肺纤维化中的关键作用，展示了中西医结合的研究方法在现代医学研究中的潜力。

　　通过使用代谢通量分析和INCA软件工具，提供了一种精确测量细胞内代谢通量的方法，有望应用到其他中药成分的研究中，以揭示它们在细胞代谢中的作用，这种方法不仅能够深入探讨中药成分的药理作用，还能为中药的现代化和国际化提供科学依据。

　　参考文献

       Shan B,Guo C,Zhou H,Chen J.Tension IIA alleviates pulmonary fibrosis by modulating glutamine metabolic reprogramming based on[U-13C5]-glutamine metabolic flux analysis.J Adv Res.2024 May 1:S2090-1232(24)00172-3.