文献解读 | 蛋白组学与代谢组学联合分析揭示瑞香素改善慢性疼痛的机制

　　瑞香素（Daphnetin，DAP）又名祖师麻甲素，化学名为7，8-二羟基香豆素，主要存在于瑞香科属植物黄瑞香（祖师麻）中。已知具有抗炎和镇痛特性，但其背后的机制尚未完全明了。神经病理性疼痛（NP）是一种由神经系统损伤或疾病引起的慢性疼痛，对患者和社会造成了极大的负担。

　　本研究旨在应用多组学研究，探讨DAP在NP模型大鼠中的功能作用，特别是在调节脊髓微胶质细胞反应和甘油磷脂代谢方面的功能。

　　01研究方法

　　研究首先通过慢性缩窄性损伤（CCI）手术在大鼠身上建立神经病理性疼痛模型，测量了大鼠的机械撤退阈值（MWT）和热撤退阈值（TWT）。利用免疫荧光染色来观察量化脊髓背角微胶质细胞的激活情况，通过WB分析DAP处理后脊髓组织中炎症因子和信号通路相关蛋白的表达变化，包括IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X4、IRF8、IRF5、BDNF和p-P38/P38等。

　　为深入理解DAP的作用机制，研究者运用蛋白质组学和代谢组学，识别出与神经病理性疼痛相关的生物标志物，并探索DAP如何影响这些生物标志物的表达。综合分析DAP在分子层面上对疼痛信号通路的调控作用。

　　02研究结果

　　研究结果表明，DAP显著改善了MWT和TWT，显著抑制了脊髓组织中炎症因子的表达，抑制了微胶质细胞的激活。基于蛋白质组学方法，鉴定出DAP处理后的差异表达蛋白，一些与疼痛信号传导和微胶质细胞激活相关的蛋白质发生了显著变化。

　　此外还观察到DAP对炎症相关信号通路的影响，特别是对p-P38/P38 MAPK信号通路的抑制作用，这一通路在神经炎症和疼痛中起着核心作用。代谢组学分析进一步检测和量化脊髓组织中的多种代谢物，包括甘油磷脂、脂肪酸、氨基酸、糖酵解产物等。

　　研究发现，模型大鼠脊髓组织中甘油磷脂代谢发生了显著变化，这些变化与疼痛的发生和发展密切相关，而DAP处理能够显著改善这种代谢失衡，特别是通过调节磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰胆碱（PC）的合成和分解。

　　03研究结论

　　本研究通过综合运用蛋白质组学和代谢组学技术，深入探究了瑞香素对神经病理性疼痛的治疗效果及其潜在作用机制。研究人员指出DAP通过抑制炎症因子的表达和微胶质细胞的激活，显著减轻了CCI大鼠模型中的疼痛敏感性，为DAP的镇痛效果提供了分子层面的证据。

　　研究还强调了DAP对脊髓组织中甘油磷脂代谢失衡的改善作用，这可能是其缓解疼痛的另一重要机制。DAP的这些作用可能为开发新的神经病理性疼痛治疗策略提供了有价值的信息，为未来的研究提供了新的方向。

　　04研究结果展开

　　图1.DAP对CCI大鼠疼痛感知的影响

　　(A)DAP的结构式。

　　(B)实验流程图。(C)大鼠脊髓硬膜下插管，如图中所示，在L4-L5脊髓节段的硬膜下腔进行了插管。(D)在不同给药时间点CCI大鼠TWT的变化（n=6）。(E)在不同给药时间点CCI大鼠MWT的变化（n=6）。

 

　　图2.展示DAP对CCI大鼠脊髓中微胶质细胞激活及炎症因子表达的影响

　　(A)免疫荧光染色法对大鼠脊髓微胶质标记物Iba-1（绿色）进行染色。

　　(B-E)脊髓中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的WB实验及相对量化分析结果。(F)免疫荧光实验中Iba-1的荧光强度相对量化分析结果。

 

　　图3.DAP对CCI大鼠脊髓微胶质细胞中P2X4受体的影响

　　(A-D,F,G)脊髓样本中P2X4、BDNF、IRF8和IRF5蛋白的WB实验及相对量化分析结果。。(E,H,I)免疫荧光实验双重染色确定脊髓背角中Iba-1（红色）和P2X4（绿色）受体的表达情况及相对量化分析结果。

 

　　图4.展示DAP对CCI大鼠脊髓微胶质细胞中MAPK信号通路激活的影响

　　(A,B,D,E)脊髓中P38/p-P38、JNK/p-JNK以及ERK1/2/p-ERK1/2蛋白的WB实验及相对量化分析结果。(C,F,G)免疫荧光实验双重染色确定脊髓背角Iba-1和P38的表达及相对量化分析结果。

 

　　图5.展示假手术组、CCI组和DAP组脊髓样本中差异表达蛋白（DEP）的表达

　　(A,B)CCI组与假手术组之间DEPs的火山图和聚类热图。(C,D)DAP组与CCI组之间DEPs的火山图和聚类热图。

 

　　图6.展示DAP组与CCI组间差异表达蛋白（DEP）的GO和KEGG通路富集分析

　　(A,B)DAP组与CCI组间DEP的GO富集分析。(C,D)DAP组与CCI组间DEP的KEGG通路富集分析。

 

　　图7.展示假手术组、CCI组和DAP组脊髓样本的代谢组学数据OPLS-DA得分图和排列测试

　　(A,C)假手术组与CCI组脊髓样本间的OPLS-DA得分图和排列测试。(B,D)DAP组与CCI组脊髓样本间的OPLS-DA得分图和排列测试。

 

　　图8.展示假手术组、CCI组和DAP组脊髓样本中差异表达代谢物（DEM）的表达

　　(A)CCI组与假手术组间差异表达代谢物（DEM）的火山图。(B)CCI组与DAP组间差异表达代谢物（DEM）的火山图。(C)CCI组与假手术组以及DAP与CCI组间差异表达代谢物（DEM）的维恩图。(D)CCI组与假手术组以及DAP与CCI组间36个差异表达代谢物（DEM）的热图。

 

　　图9.展示DAP组与CCI组间差异表达代谢物（DEM）的KEGG富集分析

　　(A)有关代谢通路的Circos图。

　　(B)有关代谢通路的条形图。(C)有关代谢通路的气泡图。(D)有关代谢通路的弦图。

 

　　图10.展示DAP组与CCI组间差异表达蛋白（DEP）和差异表达代谢物（DEM）的关联分析

　　(A)KEGG有关通路分析。(B)DAP组与CCI组间42个差异物质的热图。(C)甘油磷脂代谢有关通路分析。

　　05总结与启发

　　该篇文献发表于Pharmaceuticals(Basel)（IF>4.3），这篇文献通过将蛋白质组学和代谢组学技术应用于中药研究，特别是在探索DAP对神经病理性疼痛治疗效果的实验设计中，深入分析了DAP对疼痛行为的影响，揭示了其潜在的作用机制，为理解中药复方的作用提供了分子层面的证据。

　　研究中采用的多组学分析方法，如火山图、热图、KEGG通路富集分析等，为揭示DAP的镇痛效果提供了全面的数据支持。通过这些方法，研究者能够更准确地评估DAP的治疗效果，并为中药在疼痛管理中的应用提供了科学依据。

　　通过多组学手段，科研人员可以更有效地设计和执行中药相关的生物医学研究，推动中药现代化和国际化的进程。

　　参考文献：

Liang W,Zhang T,Zhang M,Gao J,Huang R,Huang X,Chen J,Cheng L,Zhang L,Huang Z,Tan Q,Jia Z,Zhang S.Daphnetin Ameliorates Neuropathic Pain via Regulation of Microglial Responses and Glycerophospholipid Metabolism in the Spinal Cord.Pharmaceuticals(Basel).2024 Jun 16;17(6):789.doi:10.3390/ph17060789.