文献解读|高通量糖肽组揭示肝脏疾病糖蛋白标志物，助力实现早期诊疗

　　糖基化是蛋白质最普遍和重要的翻译后修饰之一，其原理是由糖基转移酶催化的低聚糖以糖苷的形式与蛋白质上特定的氨基酸残基共价结合的过程。

　　近年来，基于质谱(MS)的定量糖蛋白质组学，阐明了糖蛋白在生理和病理过程中的重要功能，并已成为筛选潜在生物标志物以进行癌症临床诊断的显著方法。

　　然而，在表征糖肽的定性与定量方面依然有许多不足，如在糖肽的鉴定方面，HCD在碎裂过程中可能存在全部或部分聚糖修饰的丢失，而ETD较少发生聚糖离解但需要补充激活及更多的前体离子。在糖肽的定量方面，由于糖苷键比TMT报告基团更容易解离且获得大部分的能量，从而抑制了报告离子的碎裂，不能提供准确的定量信息。

 

 

　　01研究背景

　　近日，复旦大学陆豪杰团队在National Science Review（IF 17.275）发表了一篇题为“High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis”的研究文章，开发了一种高通量特异性位点糖蛋白组的研究方法(HTiGQs)，并用此方法对人血清样品中的完整糖肽进行高通量的定性与定量分析，并可通过鉴定的生物标志物对不同肝脏疾病病程进行区分。

 

　　02研究方案

　

图1 完整N-糖肽分析技术路线图

　　该方法包括两个标记步骤。首先，引入了10-plex TMT来进行糖肽标记；其次，进行N，N-二甲基乙二胺(DMEN)标记以改善糖肽的电荷状态，从而通过ETD-MS/MS和HCD-MS/MS提高其解离效率；最后，采用HCD-pd-ETD采集模式进行高效的数据采集并通过生信分析获取肝脏疾病的生物标志物。

 

　　03研究结果

　　1.HtiGQs方法提高了完整N-糖肽的鉴定能力

　　图2 HTiGQs完整N-糖肽的鉴定能力

　　研究表明，采用10-plex TMT和DMEN共同标记的N-糖肽的鉴定数量是未标记的三倍（图2a），且肽图的匹配得分更准确（图2b）。

　　ETD-MS/MS的鉴定数量较HCD模式下更多，HCD模式鉴定的糖肽中有98%以上也在ETD模式中，表明ETD和HCD采集模式相结合更具有优势（图2c）。

　　且DMEN标记显著增加了糖肽的电荷数（图2d-2e），进而提高了ETD-MS/MS模式下对完整N-糖肽检测的可靠度（图2f）。

　　2.HtiGQs方法提高了完整N-糖肽的定量能力

　　图3 HTiGQs完整N-糖肽的定性定量准确性分析

　　为了平衡报告离子强度和识别的糖肽数量之间的关系，作者研究了不同的HCD、ETD的组合方法，用于完整N-糖肽的定性和定量，最终发现sceHCD-pd-ETD 50±10的方法鉴定效率最高和定量准确，为最佳采集方法（图3a-3c）。

　　为评估HTiGQs的动态范围和定量的准确性，使用10等份的商业IgG标准品进行评估，证实HTiGQs对于完整N-糖肽定量的准确性（图3d-3f）。

　　3.HTiGQs对于大规模血清糖蛋白组学的表征

　　图4人血清完整N-糖肽的表征分析

　　为了测试HTiGQs工作流对复杂生物样本糖基化分析的适用性，作者将该方法应用于人血清中的糖蛋白组研究。

　　与非标记完整N-糖肽相比，标记后完整N-糖肽的数量增加了75%以上（图4a）。

　　根据糖肽的分子量分布，DMEN标记有助于识别分子量较高的糖肽（图4b）。

　　结合后续的motif分析、GO功能富集分析、糖型分析、糖蛋白与糖链网络图、糖链共现网络图（4d-4g），表明HTiGQs能够在复杂的生物样本(如血清)中大规模表征完整N-糖肽。

　　4.使用HTiGQs发现肝脏疾病的生物标志物

　　图5 肝脏疾病生物标志物的筛选

　　文章对90例不同严重程度的肝病患者和健康对照的血清IgG进行了HTiGQs分析，研究总共鉴定到313个IgG完整N-糖肽，在筛选出的27个差异表达的候选糖肽中IgG1-H3N5F1和IgG4-H4N3可作为分辨肝病发展进程潜在的生物标志物（图5d-5e）。

　　最后，作者通过靶向平行反应监测（PRM）成功验证了不同样本队列中肝脏疾病糖基化的表达变化。

 

　　04总结与启发

　　在这项工作中，作者开发了一种复合的、位点特异性N-糖蛋白组定性定量的策略（HTiGQs），并通过对90例不同严重程度的人类肝病患者和健康对照的血清分析，筛选出肝脏疾病的特异性生物标记物，为肝脏疾病的早期预防诊疗提供了重要的研究思路与理论基础。

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　　参考文献

　　High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis.National Science Review(Natl Sci Rev,2023,Vol.10,nwac059).