文献解读 | 通过蛋白质组和代谢组手段揭示苦参成分杀灭耐药细菌的机制

　　在我国，天然植物一直是药物的宝贵来源，比如短萼黄连可以治疗霍乱，青蒿素可以治疗疟疾，黄芩提取物可以杀灭沙门氏菌等，表明传统中药材有着巨大的基础医学研究潜力。巧妙链接传统中药材与现代医学基础研究，应用最新组学技术平台，主动瞄准具有明显临床意义课题，已成为当前研究热点。

 

　　我国中药材研究领域学者，应用蛋白组学和代谢组学手段，挖掘出苦参中黄酮成分可以杀灭多重耐药细菌的分子机制，发表在2023年4月的Journal of Advanced Research（IF 10左右），可以看做一个新的突破。

　　01 研究目的

　　耐药细菌不断涌现并且迅速蔓延，由此产生了研发新型抗生素的迫切需求，而天然植物中可能含有多种抗菌成分，是发现新型抗生素的重要来源。本研究深入探讨苦参中两种黄酮类化合物，槐黄烷酮G (Sophoraflavanone G, SFG）和苦参黄素(kurarinone, KE），对耐受甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌作用及相关机制。

　　02 研究方法

　　1. 综合蛋白质组学和代谢组学手段，全面考察SFG和KE对MRSA的影响；2. 结合扫描电镜、荧光探针和碘化丙啶染色方法，测定细菌膜流动性、膜电位和膜完整性；3. 应用试剂盒分别测定ATP和ROS水平；
　　4. SFG对胞膜亲和活性测定-等温滴定量热法。

　　03 研究结果

　　SFG和KE显示出明显抗菌特性。机制研究表明，它们靶向细菌膜，破坏膜的合成以及完整性，抑制细胞壁合成，诱导水解，阻止细菌合成生物膜；此外，它们可以干扰MRSA的能量代谢，破坏细菌的正常生理活动；动物实验结果显示，它们显著改善伤口感染状况，促进伤口愈合。

　　04 研究结论

　　SFG和KE对MRSA的具有显著抗菌特性，它们是针对多重耐药细菌的新型抗生素候选分子。

 

　　文章摘要示意图

　　研究结果展开：图1(A)显示开展蛋白质组学的流程图，应用SFG和KE两种药物处理耐药菌后，收集样本进行总蛋白的提取，蛋白进一步应用胰蛋白酶解后，应用HPLC-MS/MS进行蛋白鉴定，获取数据后开展蛋白表达谱、功能富集、通路分析、作用网络等组学分析。

 

　　图1. 用SFG或KE处理耐药菌后进行蛋白质组分析

 

    在图1 (B)中，显示出SFG组、KE组、对照组三组的蛋白质组主成分明显分离，在(C)中可以看出SFG组上调蛋白群相对明显，而KE组下调蛋白群明显，进而在(D, E）中的火山图中，分别显示了SFG组和KE组与对照组细菌中差异表达的蛋白，佐以验证。而在(F）中则对三组细菌的差异蛋白进行了聚类分析，以热图显示。

 

　　图2. 差异蛋白质组功能富集分析

　　图2 根据研究目的，进一步挖掘了蛋白质组学数据的应用潜力，进行了差异表达蛋白的功能富集分析。（A）和（B）分别显示了SFG处理组和KE处理组，差异表达蛋白进行同源蛋白群簇分析(COG/KOG)的结果，而（C）和（D）则分别显示了两组中差异表达蛋白的通路分析（KEGG）结果。

 

　　图3. SFG处理后耐药菌的代谢组学分析

　　图3 为了了解抗菌的潜在机制，研究者们应用代谢组学手段，获取细菌代谢活动信息，并且重复验证蛋白质组学手段获取的信息。
　　（A）以OPLS-DA模型进行分析，展示了SFG组的代谢产物，与对照组相比，存在清晰不同；而(B)则对OPLS-DA分析进行了可靠性检验，验证了组间代谢物差异的真实性。在分析中，SFG组与对照组相比较，确定了192个明显改变的代谢物，其中148个下调，44个上调，相关得分及名称信息显示在（C）和（D）。而（E）则显示了代谢通路的KEGG富集分析，显示出相对明显的富集通路。

 

 

　　图4. SFG和KE抑制细菌生物被膜、细胞壁合成、蛋白运输、葡萄糖代谢等基因表达

      综合蛋白质组和代谢组分析结果，在图4中研究者依次展示了相关机制研究。

　　如(A）显示，SFG和KE组在各自不同的最低抑菌浓度（MIC），处理细菌生物被膜18小时，结晶紫染色后发现，在1/2MIC浓度都具有清晰抑制效果。而(B)显示了药物处理后，6个基因的qRT-PCR实验结果，验证了YidC2、Ftsy、icaA的相对表达量明显变化，功能涉及到细胞壁生物合成、蛋白质运输和葡萄糖代谢。

 

　　

图5. SFG和KE通过对细胞膜的破坏发挥抗菌作用

 

        图5 显示了两种有效成分处理后，对细菌形态、细胞膜流动性、渗透性等方面的影响。

　　根据已有发现，研究者首先观察这两种药物影响细菌形态的可能性。（A）显示了三组细菌电镜结果的差异，如箭头显示，SFG或KE处理后，都会导致耐药细菌形态变化，表现为不规则的凹陷和表面塌陷。有关SFG和细菌膜POPG的相互作用，研究者应用等温滴定量热法（ITC）分析。（B）显示了平衡解离常数（KD）、结合位点数量（N）和摩尔结合焓（ΔH）等参数。细菌膜的渗透性应用PI单染色法进行测定。(C）显示出，SFG或KE组在1/2最低抑菌浓度，细菌膜渗透性可见明显增加。而(D)中荧光探针的数据表明，SFG或KE组，细菌细胞膜流动性下降。而(E, F）显示，外源性添加磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）和心磷脂（CL）后，则可以逆转SFG或KE的抗菌能力。(G) 表明SFG或KE处理后，耐药细菌的膜电位都下降，而(H)显示，SFG或KE处理后，耐药细菌内ROS水平增加。

 

图6. 细菌能量产生转换通路中蛋白和代谢产物的变化

 

       研究者进一步综合分析了相关数据，在图6中着重展示了药物处理后，细菌糖酵解和TCA循环中发生的变化。

　　(A)绿色显示SFG或KE组中某类蛋白水平下降，蓝色显示某类代谢物水平下降。实验结果展示，SFG或KE处理后，细菌细胞壁破坏，导致细菌胞内ATP水平的下降(B)，而保外ATP水平的上升(C)。 而(D、E、F、G）则分别显示，1,6-二磷酸果糖（D）、乙酰CoA（E）、柠檬酸（F）和2-氧代戊二酸（G）在药物处理组中下降明显。显示在SFG或KE的作用下，耐药细菌膜通透性发生变化，造成ATP大量泄漏，细菌内部能量代谢受到干扰，最终导致细菌死亡。

 

　　图7. 细菌硝酸盐代谢和精氨酸合成通路中蛋白和代谢产物的变化

　　在图7，确证SFG或KE可以导致细菌碳水化合物代谢受损后，研究者进一步研究了细菌利用硝酸盐产生能量的能力是否同样受损。
　　结合已有数据，研究者同样发现了硝酸盐代谢和精氨酸合成通路中的变化，如（A）显示，绿色代表药物处理后细菌中表达下降的蛋白，蓝色代表下降的代谢物。结合代谢组学的分析结果，可以发现耐药菌在SFG或KE处理过后，谷氨酰胺、谷氨酸、瓜氨酸和精氨酸水平明显下降（B、C、D、E）。充分证明，SFG和KE同样影响耐药细菌对硝酸盐的利用，并抑制氨基酸的合成，导致能量代谢受到破坏。

 

　　图8. SFG和KE在处理小鼠模型中展示了良好的治疗潜力

 

       为了进一步验证SFG和KE对耐药细菌的治疗作用，研究者应用小鼠模型进行功能验证，在图8中进行了展示。

　　如（A）和（B）所示，耐药菌感染后，SFG组和KE组明显促进伤口闭合。对于伤口感染细菌量的统计(C)，和感染小鼠血清IL-6水平的统计（D），也显示了SFG组和KE组有明显积极作用。（E）则显示了不同组小鼠的病理组织检查结果，以验证SFG和KE的积极作用。

 

　　图9. SFG和KE的抗菌作用模式图

　　最后，研究者利用图9进行综合分析。显示SFG和KE两种物质，可以通过多个途径，起到杀灭耐药细菌的作用。包括：

　　1. dltB的下调，破坏细胞壁的合成；
　　2. YidC2、SecA、FtsY和MscL下调，影响细菌胞膜的合成和稳态；3. 激活细菌自溶酶，肽聚糖水解，破坏细胞壁；4. 诱发氧化应激，增加ROS水平；
　　5. 诱导细胞膜去极化，改变渗透压；
　　6. 和 7. 影响脂肪酸合成和脂肪酸比例，影响磷脂的合成，抑制细胞膜合成；8. 抑制参与能量代谢的蛋白质，导致能量的产生和转化受限。
　　9. 干扰细菌对硝酸盐的利用，抑制氨基酸的合成，导致细菌能量代谢紊乱。

　　05 总结与启发

　　本文研究了苦参的两种有效成分SFG和KE对MRSA的抗菌作用和机制。研究者以蛋白质组学和代谢组学筛选入手，寻找到相关线索，从蛋白和代谢物等分子层面入手，发现了这两种化合物破坏细菌膜完整性，抑制细胞壁合成、诱导水解、防止合成生物膜、干扰能量代谢等，进而结合部分体外体内实验，确证了这两种化合物具有开发为新型抗生素的临床潜力。

　　从这篇影响因子10分的文献，可以学习到：

　　1. 文章共9个大图，含40个左右小图，表明10分左右文献基本要求该水平的数据量；2. 蛋白质组学分析和代谢组学分析贡献了至少2/3的panel，充分表明多组学和生物信息分析在科学研究前沿中的作用；3. 文章布局清晰合理，给出全文图形摘要和小结式示意图，妥妥加分项；4. 华测艾研多组学研究中心拥有多年组学平台服务经验，在数据分析和制作图表方面，可以一步到位，辅助客户发表高水准的文章。

　　参考文献
　　J Adv Res. 2023 May 1;S2090-1232(23)00123-6. Antimicrobial activities of lavandulylated flavonoids in Sophora flavences against methicillin-resistant Staphylococcus aureus via membrane disruption