文献解读 | 聚焦非靶向代谢组学：研究犬糖尿病与人类1型糖尿病的相似性

　　目前，关于犬糖尿病的发病机制仍存在知识空白。为了验证犬糖尿病与1型糖尿病(T1D)患者具有相似代谢紊乱的假设，作者通过液相色谱-质谱(LC-MS)的技术分析品种和体重匹配的糖尿病(n=6)和健康(n=6)狗的血清代谢物谱图。基于已知和未知代谢物的热图分析的糖尿病组和对照组的不同聚类分析，随机森林分类正确识别每组中的5/6只狗，总错误率=16.7%。

　　01 研究方向

　　根据数据分析结果，糖尿病的狗表现出糖酵解/糖异生中间产物(例如，葡萄糖/果糖，C6H12O6酮基己糖、脱氧己糖，(P < 0.01))，色氨酸代谢物(例如，吡啶甲酸、硫酸吲哚酚、邻氨基苯甲酸盐，(P < 0.01))显著下调。

　　与健康的狗相比，糖尿病的狗的多种氨基酸(AA)、AA代谢物和胆汁酸也显著降低(P < 0.05)，但缬氨酸除外，(缬氨酸在糖尿病动物中升高(P < 0.05))。糖尿病犬与健康犬的代谢组学特征与人类T1D中报告的代谢组学特征有相似之处(例如糖酵解/糖异生代谢物、胆汁酸和支链氨基酸升高的变化)。需要进一步的研究来评估犬糖尿病的机制，从而为人类疾病提供新的机制见解。

　　02 代谢物提取

　　所有血液样本都是在上午8点到下午4点之间采集的。使用针头和注射器通过常规静脉穿刺采集血液，并分配到含有凝血剂的试管中。在采集后30分钟内分离血清，并立即在-80°c下冷冻，并加入800 ?L 8:1:1的乙腈:甲醇:丙酮以沉淀蛋白质。

　　在离心沉淀蛋白质之前，让样品在冰上冷却30分钟。将上清液(750?L)转移到新的微量离心管中，并在温和的氮气流下干燥。
　　将干燥的样品在100 ?L0.1%甲酸水溶液中复溶，用于液相色谱-质谱(LC-MS)分析。使用Thermo QE Orbitrap质谱仪(质量分辨率35000@m/z=200 ),配有Dionex UHPLC(超高效液相色谱)和自动进样器，进行LC-MS，ESI正负离子模式进行分析。

　　03 结果

　　从提取的血清样品中以正离子和负离子模式检测到200种已知的代谢物。糖尿病犬和健康犬之间显著不同的已知代谢物的热图显示了两个组群的聚类。这些数据证明了代谢组学对糖尿病和非糖尿病犬进行分类的能力。

 

　　热图(a)显示已知代谢物在糖尿病组的狗与健康组的狗之间的显著差异(p<0.05) 热图(b)显示组间前50位已知和未知代谢物显著不同(p<0.05)。组在图的顶部用红色(糖尿病组，n=6)或绿色(健康组，n=6)表示。对应于栏的单个狗品种显示在图的底部，并对数据进行求和归一化、对数转换和自动缩放。

　　与对照组相比，通过类别和/或途径、变化方向和倍数变化对糖尿病动物中鉴定的已知代谢物进行分类正如预期的那样，糖酵解/糖异生的中间产物和糖在糖尿病组中显著上调，而参与色氨酸代谢的代谢物浓度下调。

　　多种AA和AA代谢物在糖尿病组中显著降低，包括脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，而支链AA、缬氨酸则较高。
　　在糖尿病狗中，初级和次级胆汁酸，牛磺鹅去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸等显著降低。糖尿病组的脂质溶血磷脂酰乙醇胺和丁酸甜菜碱较低，而3-羟基癸酸比对照组高。

　　随机森林分类显示了很好的组预测，每组中有5/6的动物被正确识别，16.7%的出袋(OOB)误差率。在研究进行后3个月，通过这种方法被错误分类到糖尿病组的健康对照狗被证实在禁食和喂食状态下血糖正常。随机森林重要性图确定了对数据进行分类的15种关键代谢物，其中邻氨基苯甲酸盐、葡萄糖、葡萄糖胺和溶血磷脂酰乙醇胺对分类的影响最大。

 

　　(a)随机森林变量的重要性图。平均下降准确度是在没有每种代谢物的情况下模型性能的量度。较高的值表面该代谢物在预测组中的重要性(糖尿病vs.健康组)。代谢物去除会导致模型失去预测的准确性。(b)来自(a)数据进行求和归一化、对数转化和自动缩放
　　在这项使用非靶向代谢组学评估的研究中，发现禁食糖尿病狗和健康狗的代谢组学特征显著不同，使用已知和未知代谢物表达的组有明显的聚类。基于随机森林分类，每组中有5/6 (83%)只狗被正确分类，考虑到样本量较小，这是一个很好的结果。

　　被错误归类的那只犬，在检测中表现出类似糖尿病类型：上调的肌肽，下调的组氨酸、n-乙酰-L-亮氨酸和多种胆汁酸。可能原因包括代谢组学特征的个体差异、环境或饮食因素、尚未确定的糖尿病前期状态或其他未诊断的基础疾病。

　　研究还发现糖尿病狗的初级和次级胆汁酸水平较低，并且在患有T1D和T2D的人中已经鉴定出多种胆汁酸的紊乱。胆汁酸被认为具有内分泌功能，并参与葡萄糖稳态。增加胆汁酸代谢功能复杂性的是与肠道微生物群的相互作用最近研究表明，这种基因在患有糖尿病的人类和啮齿类动物中发生了改变。

　　在目前的研究中，没有评估肠道微生物群，胆汁酸变化的原因不明。鉴于胆汁酸在新陈代谢中的重要作用，有必要进行进一步的研究。

　　04 总结与启发

　　1. 研究发现糖尿病狗的代谢组学特征与健康的非糖尿病狗显著不同；
　　2. 首次对糖尿病犬的代谢组学特征进行评估，确定了糖尿病患者代谢紊乱的相似性和差异性；
　　3. 需要进一步研究，在纵向研究设计中增加样本量，并可能通过标准化饮食来证实本文报道的发现，并确定促成这些代谢变化的潜在机制；
　　4. 关于犬糖尿病的发病机理仍存在许多未知因素，代谢组学改变可能是在临床发病前检测犬糖尿病的重要潜在生物标志物。检测糖尿病前期状态的能力可能是该领域未来发现的关键组成部分并进一步确定狗作为人类T1D潜在模型的效用。

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