文献解读 | 顶级期刊CELL综述助您成为代谢流领域高手

　　本文出自业内顶级刊物《Cell》，介绍代谢组学与基于稳定同位素示踪的代谢流方法，两者之间既有联系又有区别的关系，重点描述了代谢物测量的基础知识，包括样本准备、色谱质谱分析和数据解释，并描述了相关技术在研究领域的广泛应用及未来展望。

　　01广泛的应用领域

　　图1.显示代谢组学具有广泛的应用领域

　　比如：医学领域中的生物标记物、疾病机制、药物靶点识别等；生化与生物工程领域的代谢通路映射、酶调节、提高产率等；食品和农业领域中的营养组成分析、农作物健康判断、健康饮食选择等；环境领域中的微生物群落分析、营养循环分析、生物修复研究等。

　　02浓度与速度：理解代谢组与代谢流

　　代谢组学并不能反映代谢研究的全部，假如把代谢物想象成行驶在公路上的汽车，代谢物浓度（汽车数量）并不总是与代谢物通量（汽车流量）正相关，比如在大堵车发生时，公路上汽车数量相当拥挤（代谢物水平高），但车流量几乎为零（代谢通量低），因此仅仅理解代谢物浓度变化是不够的，代谢物水平的提升往往也可能是由于消耗减少而导致的，所以对于代谢通量的研究也是非常重要。

　　结合已有同位素示踪剂的经验，结合稳定同位素标记与高通量质谱或NMR数据分析的代谢流技术，已成为推断代谢通量的首选手段。

　　图2.显示代谢物水平与代谢通量的区别

　　(A)代谢组学测量代谢物浓度，同位素示踪研究代谢通量变化。(B)以糖酵解通路为例，说明浓度和通量之间的区别，比如说，在培养酵母时，移除葡萄糖会减少糖酵解的通量，但某些糖酵解中间体的含量却会增加，比如说PEP。FBP指果糖-1,6-二磷酸；PEP指磷酸烯醇丙酮酸。

　　03研究范畴：代谢核心与外延

　　所有生命体都需要代谢作用，将摄入的物质转化为能量和自身，这一过程所涉及的代谢反应数量因生物体而不同，范围在几百到几千个不等，但一些核心代谢反应相当保守；

　　其中的代谢物种类从细菌到哺乳动物大致相同，比如所有生物体都需要核苷酸和氨基酸来合成DNA、RNA和蛋白质，所有细胞都被脂质双层膜包围，并以碳水化合物和脂质的形式储存能量，这些核心代谢途径，比如糖酵解、磷酸戊糖通路（PPP）、三羧酸循环（TCA循环）、氨基酸和核苷酸通路，构成了大约100个保守的代谢网络核心。

　　

表1.显示代谢物对蛋白与DNA等大分子产生的影响，比如ATP为蛋白质提供磷酸根从而生成磷酸化修饰，乙酰辅酶A提供乙酰化修饰等

　　有关代谢研究的外延，是指生物系统中代谢小分子的总体，比如说表1显示的大分子修饰的供体，比如说神经递质、激素、抗生素、脂质等，当然由于脂质数量众多且与水溶性代谢物大不相同，脂质检测已经形成自己的“组学”领域（脂质组学）；

　　除了内源性代谢物，食物链中较高的生物体还含有其他代谢物，比如人体也会含有药物、人造香料和其他外源性物质，以及其代谢副产品；

　　当然除了已知的代谢物，仍然存在许多未知的代谢物，这些都属于代谢相关研究领域。

　　04代谢组研究步骤

　　代谢组学研究，包括采用同位素示踪后的代谢流研究，都包括三个基本步骤：样本准备、代谢组测量和数据分析。

　　图3.展示了代谢组学研究流程

　　主要分为：1.代谢物提取，样本类型可包括血清、尿液、细胞及培养液以及组织等，环节可包括液氮研磨、冰冷有机溶剂提取等；

　　2.色谱分离，可依据代谢物的挥发性进行GC（气相色谱）分离，依据代谢物的极性进行HILIC（亲水作用色谱）分离，依据代谢物的疏水性进行RP（反相色谱）分离；

　　3.质谱检测，根据质谱仪特点，可应用TOF、Orbitrap及四极杆等类型设备；

　　4.数据分析，基于高通量数据处理的代谢物定性与定量鉴定，其中挑战包括确保检测的特异性，区分真正的代谢物和碎片，避免误识别，对于未知化合物，可能需要进一步应用MS/MS（串联质谱）或NMR（核磁共振）来确定。

　　在每个环节中，都存在关键步骤，比如说在代谢物提取过程中，快速的酶淬火步骤非常关键，可以确保代谢物不被进一步代谢或降解；在分离过程，色谱类型选择是重要事项；而质谱检测阶段，高灵敏度对于准确检测代谢物至关重要；最后，在数据分析阶段，准确鉴定代谢物是研究的关键部分。

　　05色谱分离与质谱鉴定

　　色谱在代谢组学中的作用是将分析物进行分离，这可以增强代谢物的检测覆盖率，并提高质谱分析的准确性，对于解决电喷雾离子化过程中的离子竞争问题至关重要，减少了丰富离子对其他共同离子化物种信号的抑制，从而提高了低丰度物种的检测能力，并避免了因丰富物种浓度变化而引起的定量伪影。

　　此外，色谱法还能分离具有相同分子式但不同结构的同分异构体，如亮氨酸和异亮氨酸，这对于区分代谢物具有重要意义。

　　质谱具有出色的分辨率和灵敏度，能够检测低丰度代谢物且不受相近物种的干扰，现代质谱能够实现纳摩尔浓度代谢物的检测，高分辨率质谱可以区分具有微小质量差异的代谢物，例如区分肌酸和亮氨酸。

　　此外，质谱技术还能区分同位素标记的不同重核物种，这对于同位素示踪研究非常重要。质谱检测要求将液体提取物离子化，与色谱联用的电喷雾离子化是一种温和的离子化过程，能够产生完整的(去)质子化代谢物离子，常用设备类型包括时间飞行（TOF）、轨道阱（Orbitrap）和四极杆。

　　图4.阐述了液相色谱-质谱（LC-MS）的基本概念

　　A.在LC-MS分析过程中，首先通过液相色谱（LC）分离代谢物，然后通过电喷雾等离子化技术将代谢物转化为气相离子，最后利用质谱仪（MS）进行检测。质谱仪根据代谢物的质荷比（m/z）记录其信号强度。

　　B.质谱仪的分辨率是指其区分质量相近代谢物的能力。高分辨率质谱仪能够识别并区分具有微小质量差异的代谢物，这对于精确分析复杂样品中的代谢物至关重要。

　　C.色谱法对于分离质荷比相同但结构不同的同分异构体至关重要。保留时间（RT）是指代谢物在色谱柱中移动所花费的时间，这一参数对于代谢物的鉴定和定量分析非常重要。

　　D.串联质谱（MS/MS）通过进一步碎裂代谢物离子来提供有关化合物内部化学基团的信息，这有助于识别和确认代谢物的结构。通过分析MS/MS产生的碎片离子，可以更准确地鉴定代谢物。

　　06数据处理与解析

　　在质谱分析中，数据处理是将原始数据转化为有用信息的关键步骤。这涉及到将质谱数据转换成注释表格，表格中记录了样本中各个峰值的身份和强度。

　　通过计算算法挑选峰值、对齐样本间的峰值，并量化其强度，我们可以从通常超过10,000个峰值中筛选出有意义的信号。

　　大多数峰值可能来源于环境污染物、加合物或源内碎片，而非代谢物分子离子，这些可以忽略不计。我们关注的是那些代表已知代谢物的峰值，或是在不同生物学条件下有显著变化的峰值。

　　利用精确的质量和保留时间，结合开源软件如Maven，我们可以识别已知代谢物，并将其信号强度数据化。

　　此外，XCMS这一开源程序帮助我们找出在不同生物学条件下有差异的峰值，通过匹配保留时间和/或MS/MS谱图模式来识别这些代谢物。

　　在代谢组学数据的解释过程中，我们首先要理解信号强度与代谢物浓度之间的关系。在质谱分析中，信号强度通常与代谢物浓度呈线性关系，这允许我们根据离子计数的变化推断相对含量。

　　然而，由于不同化合物的响应因子差异显著，绝对定量需要与标准品比较，通常通过添加同位素内标来实现。

　　如果没有同位素标准品，可以通过标记生物样本来间接进行。一旦建立了参考条件下的代谢物水平，就可以通过相对定量来确定其他条件下的水平。

　　此外，使用聚类热图和主成分分析等工具，我们可以直观地展示代谢物浓度变化的模式，并识别出在不同条件下显著变化的代谢物。对于同位素示踪数据，校正天然同位素丰度并使用堆叠条形图来可视化标记模式是有帮助的。

　　最终，通过综合分析结构、代谢途径和生物学关联，我们可以从数据中提取关键信息，并利用软件辅助识别受影响的代谢途径，尽管这一过程可能存在局限性，需要结合广泛的代谢生物化学知识和文献阅读来有效解释数据。

　　图5.展示了代谢组数据分析的案例，数据来源于细胞和线粒体基质代谢物对三种不同呼吸链抑制剂的反应变化

　　研究者通过聚类热图（A）展示了代谢物浓度的变化，图中仅显示了在至少一种条件下浓度变化达到2倍的代谢物。

　　通过主成分分析（B），研究者能够评估样本间的总体相似性或差异性。

　　条形图（C）显示了特定代谢物，如天冬氨酸的数据，并通过学生t检验确定统计显著性，同时使用Benjamini-Hochberg对p值进行校正，以控制假阳性率。图中*表示p值小于0.05，即该代谢物的变化在统计上是显著的。

　　（D）显示利用MetaboAnalyst软件包识别受影响的代谢通路，这基于两个标准评估：一是表现出至少2倍浓度变化；二是综合考虑“通路影响”，考虑发生改变的代谢物是否位于通路的中心或边缘位置。如图中所示，红色表示通路影响得分，其中最受影响的途径是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。

　　对于（D）中的点，（E）表示该物质所在的代谢通路图，图中矩形代表某代谢物，发生改变的代谢物以红色标记显示。这种可视化方法有助于研究者理解数据中的关键信息，并识别出在特定生物学条件下受到影响的主要代谢途径。

　　07可结合研究方向

　　1.发现特定代谢物代谢组学能够帮助识别具有特定生物学功能的代谢物。通过敲除某个酶并观察代谢组的变化，可以确定该酶的生理底物。例如，IDH1/2突变的研究揭示了2-羟基戊二酸作为癌症驱动因素的作用。

　　2.观察全局变化代谢组学不仅有助于发现单个重要代谢物，还能提供整体视角，展示多个相关代谢物的同时变化。这有利于我们理解复杂生物过程和常见疾病（如糖尿病、自闭症）中的代谢特征。此外，研究表明代谢网络对营养环境比遗传变异更敏感。

　　3.追踪活跃通路为了更好地了解代谢途径的实际活动，同位素示踪技术被用来测量代谢通量。通过引入示踪剂，并观察下游代谢物标记模式的变化，研究人员可以评估不同代谢路径的相对活性。这种方法特别适用于评估糖酵解与戊糖磷酸途径之间的通量比例，并且还揭示了一些非预期的代谢现象，比如谷氨酰胺代谢过程中出现的还原羧化作用。

　　4.生物体内代谢追踪在多细胞生物体内进行代谢通量分析时，活体动物中的同位素示踪研究成为一个重要方向。尽管这项技术比较复杂，但借助适当的计算方法和实验设计，科学家们能有效解析不同组织间的代谢相互作用。例如，通过输注标记的谷氨酰胺或葡萄糖实验，发现了循环乳酸作为TCA循环主要底物的新机制，为理解体内代谢调控提供了新的见解。

　　图6展示了代谢流技术来进行代谢活动的通路计算

　　图中X、Y、Z、P和Q代表不同的代谢物，箭头表示反应过程，Fin和Fout分别代表生成和消耗Y的代谢通量（反应速率）。图表反映了不同标记形式的Y的池大小。

　　(A)根据质量守恒定律，在代谢稳态下，代谢物池的流入和流出必须保持平衡。

　　(B)当X从未标记状态瞬间切换到完全标记状态时，Y会随时间以单指数动力学逐渐被标记。尽管存在同位素标记，但如果其他条件不变，细胞仍然保持代谢稳态，池大小和通量保持恒定。标记动力学取决于池大小和通量，这一点可以通过方程式来展示。

　　(C)现在考虑Y可以通过两种不同的反应生成，分别使用未标记的底物P和标记的底物Q。在同位素稳态下，Y的未标记与标记池大小之比揭示了两条不同途径的相对通量。

　　(D)通过[1,2-13C]葡萄糖追踪磷酸戊糖途径的通量，以及[U-13C]谷氨酰胺追踪三羧酸循环的通量。白色球代表12C原子，阴影球代表13C原子。糖酵解用红色表示；磷酸戊糖途径用蓝色表示；经典的三羧酸循环用黄色表示；还原性羧化作用用绿色表示。

　　08挑战与展望

　　1.分析流程标准化：代谢组学需要统一分析流程，以便于实验室间数据共享和自动化定量。

　　2.扩展代谢物检测范围：目前检测的代谢物数量与实际存在的代谢物数量有较大差距，需要发现更多未知代谢物。

　　3.代谢的空间组织捕捉：利用荧光代谢物报告器和成像质谱技术，实现代谢活动的空间和时间分辨率，提高亚细胞器水平的代谢物检测精度。

　　4.数据处理与建模：结合同位素追踪，使用多种示踪剂和测量方法来分析代谢活动，需要发展数学建模和软件工具来处理和解释复杂的代谢数据。

　　5.软件工具开发：开发易于使用的软件进行定量通量分析，以实现多室系统通量测定，这对于理解代谢过程和推动相关领域发展至关重要。

　　参考文献

      Jang C,Chen L,Rabinowitz JD.Metabolomics and Isotope Tracing.Cell.2018 May 3;173(4):822-837.doi:10.1016/j.cell.2018.03.055.PMID:29727671;PMCID:PMC6034115.