SFRP2基因的表观遗传沉默可作为结直肠癌的临床生物标志物

    结直肠癌是第三大常见的癌症。据估计到2040年，结直肠癌的发病率可能会增加多达63%。结直肠癌目前的整体五年生存率为63%，明确原发灶的早期诊断可以将生存率提高到91%。而晚期病例则会降至12-14%。通常，结直肠癌起源于大肠上皮细胞中的遗传和表观遗传改变，这些改变在致癌和癌症进展中扮演着关键角色。在结直肠癌中，DNA甲基化是最重要的表观遗传改变，抑制基因的启动子区，导致它们的失活，并可能导致无控制的细胞增殖。

 

    目前有研究标明，分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）可能是结直肠癌的潜在生物标志物。然而，其诊断作用仍然不明确。在本研究中，探讨了一队列结直肠癌患者的血、脂肪和结直肠组织样本中SFRP2甲基化水平的意义，从而识别其作为新的生物标志物的效用。

 

 

方法学

    本文通过qPCR分析了健康参与者和结直肠癌患者的SFRP2基因的表达情况，并用450 K DNA阵列和DNA测序来了解其甲基化状态，并评估其作为结直肠癌生物标志物的潜力。此外，还调查了重组人SFRP2（rhSFRP2）作为治疗靶点对细胞增殖、迁移以及与癌症发生和Wnt通路相关的关键基因表达的影响。

 

结论

    在结直肠癌患者的全血中，SFRP2的甲基化可以预测肿瘤的临床阶段（I+II vs. III+IV）（曲线下面积=0.653），淋巴结侵犯阶段（曲线下面积=0.692），以及结直肠癌的复发阶段（曲线下面积=0.699），这些都具有统计学意义（p<0.05）。此外，注意到相比于癌旁组织，在肿瘤组织中的SFRP2全部低甲基化（p<0.001）。值得注意的是，接受新辅助治疗的结直肠癌患者表现出较低的SFRP2甲基化水平，而在未经治疗的患者中，SFRP2的甲基化与较差的总生存有关。

 

结果 1 SFRP2启动子的甲基化为结直肠癌的生物标志物

 

    在本研究中，本文测量了全血和脂肪组织中SFRP2基因的表达和甲基化水平。如下图所示，没有发现健康者与结直肠癌患者之间在全血中SFRP2启动子甲基化水平上有显著差异。此外，没有观察到在全血中SFRP2甲基化或表达水平之间有任何显著差异。当观察预后时，发现结直肠癌晚期患者的SFRP2甲基化水平比早期患者低（p=0.044），而且比健康参与者低（p=0.035），AUC为0.879（95% CI 0.700-0.942），这一差异在调整了临床变量之后仍然显著。结直肠癌患者如果有淋巴结侵犯，他们的SFRP2甲基化水平也会比那些没有淋巴结侵犯的患者低（p=0.014），AUC为0.844（95% CI 0.736-0.951）。如果结直肠癌患者出现复发，他们的SFRP2甲基化水平也会比那些没有复发的患者低（p=0.013），AUC为0.821（95% CI 0.700-0.942）。同时，还测量了脂肪组织中SFRP2基因的表达和甲基化水平。没有发现健康参与者与结直肠癌患者之间在脂肪组织中SFRP2启动子甲基化水平上有显著差异。然而，结直肠癌患者有较低的SFRP2表达水平。此外，没有观察到在脂肪组织中SFRP2甲基化或表达水平之间有任何显著差异。

 

 

结果 2 同一队列的肿瘤组织中SFRP2基因的DNA甲基化作为结直肠癌的生物标志物

    本文利用Infinium DNA甲基化450K数据评估了结直肠癌患者和健康志愿者的结肠组织中SFRP2基因的表达和甲基化情况。如下图A所示，SFRP2基因的全面β甲基化在肿瘤区域高于非肿瘤区域（p<0.001）。不过，没有发现两个区域之间在SFRP2表达上的显著差异（p=0.171）。如下图C和F所示，SFRP2基因的全面β甲基化在肿瘤区域确实高于非肿瘤区域（p<0.001）。此外，本文还注意到SFRP2在肿瘤区域的表达通常低于非肿瘤区域（p<0.001）。最后，对结直肠癌肿瘤的单细胞RNA测序结果进行分析，发现在非肿瘤区的癌细胞中SFRP2的表达相对较高，而在肿瘤核心和肿瘤边界区的癌细胞中SFRP2的表达则较低。在细胞级别，本文看到SFRP2主要在非肿瘤区的基质细胞和肌成纤维细胞中表达。

    接下来，本文探讨了可能影响结直肠癌患者中SFRP2启动子甲基化的因素。为此，进行了一项调整了年龄、性别和体质指数的线性回归分析。发现肿瘤的位置（结肠或直肠）与SFRP2启动子甲基化有关（p<0.05）。具体来说，发现在结肠中的SFRP2启动子的甲基化程度高于直肠。此外，还发现接受过新辅助治疗的结直肠癌患者与未接受过新辅助治疗的患者相比，其SFRP2启动子的甲基化程度更高。在Kaplan-Meier图中，可以看到，与高甲基化状态相比，低甲基化状态的非治疗结直肠癌患者的生存期更短。为了找出与SFRP2甲基化相关的其他因素，进行了一项逻辑回归分析，并将SFRP2甲基化分为低和高两个级别。发现在结肠中的SFRP2甲基化更倾向于发生在那些没有淋巴结浸润的患者身上。而且，与未接受过新辅助治疗的患者相比，那些接受过新辅助治疗的患者其SFRP2甲基化程度更高。在早期（I+II阶段）的结直肠癌患者中，我们可以看到，与高甲基化状态相比，低甲基化状态的患者的数量更多。

 

 

结果 3 SFRP2抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移

    最后，本文使用HCT116细胞模型研究了SFRP2，分析了这些细胞中SFRP2启动子的甲基化情况。发现在HCT116中，SFRP2的启动子在本文分析的7个CpG位点上都是完全甲基化的。这些位点的甲基化百分比分别是：93±3.7%（位点1）；89±2.5%（位点2）；97±2.5%（位点3）；99±1.5%（位点4）；92±4.3%（位点5）；98±2.5%（位点6）和97±3.6%（位点7）。然后，用AZA（一个DNA甲基转移酶抑制剂）来处理HCT116细胞，研究了这个完全甲基化的启动子是否会影响SFRP2的表达。在AZA处理后，发现SFRP2的表达是可以恢复的，并且随着1、5和10 µM AZA的增加而增加。因为SFRP2在HCT116中没有表达，用重组人SFRP2（rhSFRP2）来处理这些细胞。在48小时的治疗后，看到在0.1、0.5和1 µg/mL的rhSFRP2浓度下，细胞的存活率保持在100%。在2.5 µg/mL的rhSFRP2中，细胞的生存率下降到了81%，在5 µg/mL的rhSFRP2中，则进一步降低到了66%，这与对照组相比有显著差异。随后，本文评估了rhSFRP2在细胞迁移中的作用。在24小时的划痕后，没有观察到rhSFRP2和对照组之间有任何迁移差异。但是在48小时后，发现在5 µg/mL的rhSFRP2中，细胞的迁移减少了。此外，还发现治疗与rhSFRP2会导致AXIN2表达的降低。而在CTNNB1、TIAM1和VEGF基因中，没有观察到任何表达变化。

 

 

参考文献

 

Boughanem H, Pilo J, García-Flores LA, Arranz I, Ramos-Fernandez M, Ortega-Castan M, Crujeiras AB, Sandoval J, Macias-Gonzalez M. Identification of epigenetic silencing of the SFRP2 gene in colorectal cancer as a clinical biomarker and molecular significance. J Transl Med. 2024 May 27;22(1):509. doi: 10.1186/s12967-024-05329-x. PMID: 38802858.