文献解读 | 揭秘胃肠道间质瘤：蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的前沿研究

　　胃肠道间质瘤（GIST）是胃肠道最常见的间充质肿瘤，常见发生部位包括胃、回肠、十二指肠、结肠、直肠、及食管，其转移率和复发率高。临床目前存在科研问题包括：胃肠道间质瘤的分子亚型分层尚不充分；转移性GIST一线治疗药物伊马替尼有效性因位置而异等。

　　研究人员目的旨在通过分析GIST的蛋白质组学特征，实现分子亚型分型，探索与药物疗效相关的机制，以提高患者生存率。

　　01研究方法

　　收集193个GIST肿瘤和127个相关非肿瘤邻近组织（NAT），对FFPE样本根据HE染色进行显微切割，以定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术进行检查，通过联合分析多组学数据，系统性揭示GIST分子生物学特征。并进一步利用GIST细胞系和小鼠模型，开展相关功能实验来进行实验验证。

　　02研究结果

　　1.定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术分析揭示了不同位置、不同组织学分级的GIST分子特征；

　　2.联合蛋白质组学分析鉴定了4组具有不同临床和分子特征的肿瘤。

　　3.数据分析挖掘出MAPK7与GIST肿瘤细胞增殖相关，并进一步通过功能实验验证；

　　4.数据分析发现SQSTM1表达增加，验证分析该分子过表达抑制甲磺酸伊马替尼疗效；

　　5.数据分析挖掘出SRSF3，并进一步验证其在促肿瘤细胞增殖和预后不良中的作用。

　　03研究结论

　　该研究提供了大队列GIST蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学综合研究数据，为后续GIST研究提供基于临床的肿瘤蛋白质组学数据资源。

　　研究着重强调了组学数据与GIST相关治疗的相关性，比如通过数据挖掘，发现SQSTM1过表达与伊马替尼敏感性降低相关，以此可以提高临床医生预测能力，来判断GIST患者对伊马替尼治疗反应。

　　此外，研究中的蛋白质组学亚型，有助于预判患者复发风险，可以进一步结合临床治疗，包括靶向或免疫疗法的应用。

　　04研究结果展开　　

 

图1.GIST患者开展蛋白质组学研究的队列设计及样本情况

　　共收集193个GIST样本，包含80个胃部，46个空肠和回肠，45个十二指肠，12个食管，10个结直肠，以及127个配对NAT样本，用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。相关临床数据可见原文，就用药而言，未接受甲磺酸伊马替尼治疗的患者150例，接受甲磺酸伊马替尼治疗的患者43例。

　　

图2.组学分析挖掘出MAPK7分子影响细胞增殖从而促进GIST进展

　　a.潜在生物标志物筛选，挖掘出20个激酶，14个转录因子。

　　b.20种激酶的差异热图。

　　c.散点图显示肿瘤样本和NAT样本之间，激酶蛋白水平和活性水平的差异。

　　d.MAPK7敲低对GIST-T1细胞增殖的影响。

　　e.MAPK7敲低对GIST882细胞增殖的影响。

　　f.MAPK7过表达对GIST-T1细胞增殖的影响。

　　g.MAPK7过表达对GIST882细胞增殖的影响。

　　h.构建MAPK7突变载体；

　　i.将野生型MAPK7和突变MAPK7，重新利用GIST882和GIST-T1细胞敲低，验证了野生型可以挽救敲低引起的生长抑制。

　　

图3.功能实验验证SQSTM1分子与GIST药物敏感性相关

　　a.胃GIST患者，在术后未接受甲磺酸伊马替尼治疗情况下，与空肠和回肠GIST患者的生存率没有差异。

　　b.胃GIST患者，在术后接受甲磺酸伊马替尼治疗情况下，与空肠和回肠GIST患者的生存率存在差异，表明胃GIST对甲磺酸伊马替尼药物，比空肠和回肠GIST更敏感。

　　c.胃、空肠和回肠的GIST样本中上调蛋白的通路富集分析。

　　d.胃、空肠和回肠样本数据分析挖掘出6种药物敏感性相关蛋白。

　　e.散点图显示SQSTM1表达高低、药物敏感性以及差异蛋白之间相关性

　　f.胃、空肠和回肠GIST样本中SQSTM1病理切片分析。

　　g.敲低和过表达SQSTM1后，GIST-T1细胞所呈现的甲磺酸伊马替尼剂量反应曲线。

　　h.敲低和过表达SQSTM1后，GIST-T1细胞所呈现的甲磺酸伊马替尼剂量反应IC50变化。

　　i.GIST-T1细胞在低葡萄糖环境和高葡萄糖环境中，对甲磺酸伊马替尼所呈现的IC50变化。

　　j.相关性分析表明与SQSTM1表达呈正相关的蛋白质在葡萄糖代谢相关途径中富集。

　　k.sh-Ctrl、OE-SQSTM1、OE-Ctrl、sh-SQSTM1四组细胞分析，发现葡萄糖代谢相关基因表达存在差异，与对照相比，葡萄糖代谢在sh-SQSTM1细胞中表达水平较低，在OE-SQSTM1细胞中表达较高

　　l.sh-SQSTM1细胞中葡萄糖消耗降低。

　　m.sh-SQSTM1细胞中糖酵解速率降低。

　　n.切片染色发现，SQSTM1表达较高的GIST样本中血管浸润增加。

　　o.sh-Ctrl、OE-SQSTM1、OE-Ctrl、sh-SQSTM1四组细胞分析，发现血管生成相关基因表达存在差异。

　　

图4.GIST患者的蛋白质组学亚型分析

　　a.150份未接受甲磺酸伊马替尼治疗的肿瘤样本，共识聚类分析确定了4个聚类，注释了特征蛋白的突变信息、临床特征和相对丰度。

　　b.4个聚类的功能通路富集分析。

　　c.4个聚类中患者的生存曲线分析情况。

　　d.桑基图展示蛋白质组学分簇、NIH分类和肿瘤位置之间的关联情况。

　　e.4个蛋白质组学分簇中驱动标记物筛选情况。

　　f.4个蛋白质组学分簇中标记蛋白的热图分析。

　　g.对标记蛋白SRSF3的验证分析，切片染色发现SRSF3在肿瘤中高表达。

　　

图5.功能实验验证SRSF3可促进GIST进展

　　a.蛋白质印迹分析（上）和RT-qPCR（下），证实GIST-T1或GIST882细胞中敲低或过表达SRSF3的情况。

　　b.细胞增殖实验展示，OE-SRSF3细胞增殖增加，而sh-SRSF3细胞增殖减少。

　　c.集落形成实验展示，OE-SRSF3细胞增殖增加，而sh-SRSF3细胞增殖减少。

　　d.侵袭实验显示，OE-SRSF3细胞侵袭能力增加，而sh-SRSF3细胞能力减少。

　　e.愈合实验显示，OE-SRSF3细胞侵袭能力增加，而sh-SRSF3细胞能力减少。

　　f.成瘤实验显示，OE-SRSF3细胞成瘤能力增加，而sh-SRSF3细胞能力减少。

　　

图6.功能实验验证发现SRSF3通过增加氧化应激来促进GIST进展

　　a.与SRSF3相关的上游转录因子表达热图。

　　b.相关性分析展示与SRSF3呈正相关的上游转录因子分析，挖掘出MER1。

　　c.为验证MIER1是调节SRSF3的上游转录因子，荧光素酶报告基因测定展示，GIST-T1细胞中MIER1过表达，明显增强了SRSF3 pro-pGL4报告基因的表达。

　　d.染色质免疫沉淀测序分析发现，SRSF3的启动子区域富集，证实了MIER1在调节SRSF3转录中的作用。

　　e.染色质免疫沉淀qPCR发现，MIER1蛋白可以与SRSF3的启动子区域结合，并激活其表达。

　　f.集落形成实验展示，OE-MIER1细胞增殖增加，而sh-MIER1细胞增殖减少，而过表达的SRSF3挽救了敲低MIER1引起的生长抑制。

　　g.相关性分析发现PRKCD是唯一与SRSF3呈正相关的激酶。

　　h.激酶活性检测发现，过表达SRSF3细胞中的PKC激酶活性，明显高于对照。

　　i.集落形成实验展示，利用PKC激酶抑制剂Go6983和N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理后，过表达SRSF3细胞增殖减少。

　　j.公共数据库挖掘发现，受PRKCD调控的磷酸化底物中，3个与SRSF3呈正相关，1个CYBA/T147呈负相关。

　　k.由于CYBA与ROS相关，用Go6983和NAC处理后，发现OE-SRSF3细胞中的ROS水平明显降低。

　　l.卡通图展示SRSF3表达对氧化应激的影响。

　　

图7.对于GIST免疫浸润特征的分析

　　a.结合临床信息、细胞类型组成（xCell评分），通路富集（GSVA评分）进行的4个免疫分簇的热图。

　　b.4个免疫分簇的生存曲线分析。

　　c.4个免疫簇的免疫和基质评分的散点密度图，4免疫簇为热（Im-I：CD4+T细胞，Im-II：CD8+T细胞和树突状细胞，Im-III：普通髓系祖细胞和嗜酸性粒细胞）和冷（Im-IV：间充质干细胞）肿瘤。箱线图表示免疫评分（上）和基质评分（右）。

　　d.桑基图揭示了蛋白质组学簇、免疫簇和肿瘤位置之间的关系。

　　e.Im-I免疫簇CD4+T细胞染色展示。

　　f.Im-II免疫簇CD8+T细胞染色展示。

　　g.Im-III免疫簇嗜酸性粒细胞染色展示。

　　h.Im-IV免疫簇MSC细胞染色展示。

　　05总结与启发

　　从这篇文章中，我们可以了解到：目前的风险分层系统主要基于肿瘤大小等因素，而基于蛋白质组的蛋白质亚型分类系统尚未被证明。作者的综合分析将患者分为4个不同的亚群，具有不同的无进展生存期（PFS），并且与高风险患者的预后密切相关。在GIST患者中，高表达SQSTM1与对伊马替尼敏感性相关联。

　　结果有助于预测患者对伊马替尼的反应，并有助于进行准确的临床随访评估和治疗决策。GIST的微环境中存在肿瘤浸润的免疫细胞，对于了解肿瘤微环境中的免疫特征至关重要。

　　从这篇影响因子相当高的Gastroenterology（IF=29）文献，我们可以学习到：

　　1.患者队列：研究使用了来自复旦大学中山医院2009年至2016年期间进行手术切除的193名GIST患者的样本。这种患者队列的建立是进行临床研究的重要方法，可以提供临床样本和相关数据用于分析和研究。

　　2.样本制备：研究使用了甲醛固定、石蜡包埋的组织标本。通过组织切片和染色，选择具有足够肿瘤纯度的样本进行后续处理。这种样本制备方法可以确保研究中使用的样本质量和一致性。

　　3.多组学数据分析：研究进行了蛋白质组和磷酸蛋白组的分析。通过对样本进行分析和标准化处理，得到了样本的注释和处理后的数据。这种多组学数据分析方法可以揭示不同分子水平上的变化和相关性，有助于了解疾病的分子机制。

　　4.细胞系和治疗：研究使用了人GIST-T1和GIST882细胞系进行实验。这些细胞系是在特定培养条件下培养的，用于研究细胞的生物学特性和治疗反应。这种细胞系和治疗方法可以为疾病的研究提供实验模型。

　　5.统计方法：研究使用了标准的统计方法来分析临床信息和多组学数据之间的关联。通过计算不同表达的蛋白质/磷酸蛋白的Benjamini-Hochberg校正的P值，评估差异表达的统计显著性。相关性分析使用Spearman相关系数。这些统计方法可以帮助研究者从数据中提取有意义的信息。

　　总的来说，这些方法包括患者队列的建立、样本制备、多组学数据分析、细胞系和治疗以及统计方法等，为开展研究其他类型肿瘤蛋白质组学，及磷酸蛋白组学，提供了实验和数据分析的方法参考。

　　参考文献

　　Sun M,Tong Y,Yuan W,et al.Proteomic characterization identifies clinically relevant subgroups of gastrointestinal stromal tumors.Gastroenterology.2023 Nov 21:S0016-5085(23)05509-9.doi:10.1053/j.gastro.2023.11.284.Epub ahead of print.PMID:37995868.