miRNA和淋巴细胞亚群可作为胃癌诊断和预后的潜在生物标志物

        胃癌(Gastric cancer, GC)是一种常见的影响消化道的恶性肿瘤，全球新发肿瘤例数排名第六，死亡率排名第二。特别是在中国，GC 的发病率很高，占全球 GC 相关病例的 42.6%和全球死亡人数的 45.0%。根据国家癌症中心 2018 年公布的最新肿瘤统计数据，中国 GC 的发病率排名第三，死亡率排名第二。这些数据表明，与其他肿瘤类型相比，GC在治疗方面面临重大挑战。由于早期没有明显的症状，大多数 GC 患者在治疗选择有限的晚期才被诊断出来。尽管 GC 的手术、化疗和靶向治疗策略有所改善，但总体生存率仍然不利。目前，胃镜检查被认为是诊断 GC 的金标准。然而，其成本和侵入性限制了其广泛使用。因此，迫切需要一种易于应用于临床实践的非侵入性或微创性血清标志物。

        目前，与 GC 相关的传统血清标志物主要包括癌环抗原(CEA)、碳水化合物抗原 CA199 和碳水化合物抗原 CA724，虽然这些标志物对 GC 的发生、复发和转移提供了一定的预测价值，但其特异性和敏感性不足以诊断早期 GC 并有效预测复发和转移。因此，进一步研究具有潜在临床意义的分子标志物对提高 GC 患者的早期检出率和预后至关重要。

 

方法学

 

qRT-PCR验证 miRNAs

        收集患者血清样本，分成 1.5 mL Eppendorf管。然后将其保存在- 80C的冰箱中以备以后使用。使用 miRNA 提取试剂盒从血清中提取 miRNA，提取 RNA 的浓度和纯度由Thermo Scientific NanoDrop测定。本研究提取的 miRNAs 质量和浓度均满足 PCR 反应的要求。以 U6 为内参基因，采用qRT-PCR 检测血清中的 hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1307-5p、 hsa-miR-3173-5p、 hsa-miR-424-5p、hsa-miR-651-5p 和 hsa-miR-296-5p。

 

MIiRNA 测序分析

        按照制造商提供的说明，使用 Trizol试剂从患者血清中提取总 RNA。为了评估RNA 完整性和DNA 污染，采用变性琼脂糖凝胶电泳。在构建RNA测序(RNA-seg)文库之前，使用 Ribo Zero RNA 去除试剂盒去除rRNA，使用 miRNA 富集试剂盒富集 miRNA。根据制造商的说明，使用 TruSeq链总 RNA 文库制备试剂盒构建RNA-seq 文库。随后，对所有小rma进行测序，通过数据处理提取潜在的 mirma，并分析其表达水平。

 

CEA、 CA199、 CA724 的检测

        采用化学发光免疫分析法检测 3 种肿瘤标志物。使用的设备是罗氏 i2000 发光免疫计。使用罗氏公司提供的相应试剂。严格按照试剂盒提供的说明书进行操作。

 

流式细胞术分析

        采用EDTA 抗凝管采集 51例 GC 患者和 50 例健康人外周血(2 mL)。采用六色流式细胞仪检测外周血淋巴细胸亚群(CD3+、CD4+、CD8+T细跑、CD19+B细胞和CD16+ CD56+ NK细胞)在细胞/uL中的合量。人源单克隆抗体包括抗 cd3 -异硫氰酸荧光素(FITC)抗体、抗 cd4 -藻红蛋白(PE)抗体、抗 cd8-别藻蓝蛋白(APC)抗体、抗cd19 -PE 抗体、抗 cd16-APC 抗体和抗 cd56 -PE 抗体(BD Multitest)，按照制造商的说明使用。细胞样本在 BD Canto II 流式细胞仪(BD BiosciencesEast RutherfordNJ，USA)进行分析。

 

结   论

        hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3173-5p、hsamiR- 296-5p 等 miRNAs和 CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞等淋巴细胞亚群在GC 中均下调，与 GC 患者的临床病理特征和预后密切相关。它们可作为预测 GC 患者早期诊断和预后的新的分子标记物。

 

结果 1：GC 组和健康组miRNA 测序结果

        本实验通过高通量 miRNA 测序，筛选 5例 GC 患者和 5 例健康人血清中的差异 miRNA。

        首先对筛选数据进行标准化，并使用箱形图可视化 miRNA 表达。盒子图显示了最小值、第 1四分位数(25%)、中位数(50%)、第 3 四分位数(75%)和最大值，表明数据分布相对对称，散点较小(下图 1A)。使用差异分析工具对基因进行差异分析，计算每个基因的p值和折查变化(FC)。根据FC≥2(上调)或S0.5(下调)且pe 0.05 的标准，共鉴定出 50个差异表达miRNAs，其中上调miRNAs 33 个，下调miRNAs 17个(下图 1B)。随后，基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析发现，PI3K-Akt 信号通路、人乳头瘤病毒感染、MAPK 信号通路和癌症通路中的蛋白多糖相对丰富。已知这些途径在 GC发展中起着至关重要的作用(下图 1C)。从这些途径中，选择六个关键 miRNAs，即 hsa-miR1306-5p，hsa-miR-1307-5p， hsa-miR-3173-5p, hsa-miR-424- 5p，hsa-miR-651-5p 和 hsa-miR296-5p，进行进一步验证，因为它们同时与 GC 相关的四种途径相关。在这些 miRNAs中，hsa-miR-1306-5p，hsa-miR-3173-5p 和 hsa-miR-296-5p 在健康组中的表达明显高于GC组。相反，GC组中hsa-miR-424-5p、hsa-miR-651-5p 和 hsa-miR-1307-5p 的信号值明显高于健康组(下图 1D)。

 

结果 2：qRT-PCR验证miRNA 测序结果

        本文使用 miRNA 芯片对 20名 GC 患者和 20名健康个体的血液样本进行了 miRNA 检测根据RT-PCR 结果，健康组 hsa-miR-1306-5p、hsamiR-3173-5p、hsa-miR-296-5p、has-miR-424-5p、hsa-miR-651-5p 和 hsamiR-1307-5p 的表达水平明显高于 GC 组(下图A-F以中位数士IOR表示)。gRT-PCR 结果与 hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3173-5p 和 hsa-miR-296-5p的 miRNA-seq数据一致。进一步分析RT-PCR 数据并结合 GC 患者的临床病理特征，发现 hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3173-5p 和 hsa-miR-296-5p 的表达水平与 GC分期相关。通过对 qRT-PCR 数据和胃癌患者临床病理特征的综合分析，发现 hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3173-5p、hsa-miR-296-5p 的表达与患者分期之间存在相关性。

        随着肿瘤分期的进展，这些 miRNAs 的表达水平显著降低。根据胃癌临床分期分为 1~2期和3~4期两组。随后，在这两组的基础上生成三种mirma的ROC 曲线，进一步证明 hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3173-5p和hsa-miR-296-5p是胃癌的预后指标。结果表明，hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3173-5p 和hsa-miR-296-5p的AUC 值均在 0.7 以上，具有较高的预测信度。通过确定 hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3173-5p 和 has-miR-296-5p 的ROC 曲线的最佳截断值，我们确定has-mir-296-5p >0.160、has-mir-1306-5p >0.160has-mir-3173-5p >0.930 和联合预测因子>0.622的截断值(p 0.05)，我们的研究结果强调了 hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-3173-5p和 hsa-miR-296-5p与胃癌的诊断和预后的密切关联，表明它们有可能作为胃癌的生物标志物。

 

结果 3：GC 患者淋巴细胞亚群的差异表达

        研究期间，实验组共 51 例 GC 患者。其中，男性 30 例，女性 21 例，平均年龄(69.02士1.36)岁。健康对照组 50 人，其中男性 29 人，女性 21 人，平均年龄(60.50士1.49)岁。两组年龄、性别分布差异无统计学意义(P> 0.05)。分析 GC 患者与健康对照组淋巴细胞亚群的表达变化，发现 GC组CD3+T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD19+ B细胞和淋巴细胞的绝对数量低于健康对照组(下图A-F，以 meanSEM 表示)。然而，上述差异表达的淋巴细胞亚群与临床病理之间的相关性分析未产生显著差异(P>0.05)。

 

结果 4：血淋巴细胞亚群的 ROC 分析结果

        根据观察到的 GC 患者和健康个体淋巴细胞亚群的业著差异，绘制 ROC 曲线并确定 AUC值。ROC 曲线分析显示 GC 患者的 AUC 值如下:CD3+T细胞:0.808(0.722-0.894)，CD4+T细胞:0.776(0.681-0.871)，CD8+T细胞:0.783(0.689-0.876)，CD8+B 细胞:0.836(0.748-0.923)，淋巴细胞.829(0.743-0.915)，所有因素(CD3+ T CD4+T CD8+T淋巴细胞和 CD19+ B)的组合 ROC 曲线 AUC为 0.828(0.745-0.912)（下图A-F）。检测不同因子(CD3+T、CD4+T、CD8+T、淋巴细胞、CD19+ B)与肿瘤标志物 CA724、CA199、CEA 表达的相关性，发现 CD4+T 细胞与 CEA 表达是负相关P=0.03)。

        然而，CD4+T细胞与 CA199 (P=0.21)或 CA724(P=0.11)无显著相关性。同样，CD3+ T细胞与 CEA（P= 0.6）、CA199(P =0.65)或 CA724 (P=0.37)之间无显著相关性CD8+T细胞与 CEA 之间的差异(P=0.17)，CA199 (P= 0.32)或 CA724(P 0.84):CD19+ B细胞与 CEA(P- 0.18)、CA199 (P= 0.13)、CA724(P= 0.86)之间的差异淋巴细胞与 CEA(P= 0.56)、CA199 (P= 0.77)、CA724(P= 0.41)之间存在差异。多因素 logistic 回归分析显示，CD3+T细胞(比值比:0.997[0.995-0.999])和CD19+B 细胞(比值比:0.032[0.002-0.434])可作为 GC 的独立预测因子。因此，血淋巴细胞亚群可有效预测胃癌的发生及预后。

 

参考文献

Li J, Chen Z, Li Q, Liu R, Zheng J, Gu Q, Xiang F, Li X, Zhang M, Kang X, Wu R. Study of miRNA and lymphocyte subsets as potential biomarkers for the diagnosis and prognosis of gastric cancer. PeerJ. 2024 Jan 19;12:e16660. doi: 10.7717/peerj.16660. PMID: 38259671; PMCID: PMC10802158.